cDNA的合成實驗原理和操作步驟
一、實驗目的掌握植物cDNA合成的原理和方法二、實驗原理反轉錄酶主要用于體外cDNA的合成。目前最常用的反轉錄酶(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它們具有依賴于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子為模板，合成出一條DNA鏈。形成的DNA是與RNA模板互補的，因而反轉錄產生的DNA分子稱之為cDNA。 三、實驗材料、器具及藥品 植物總RNA溶液。 紫外分光光度計、離心機、冰盒、口罩、手套、EP管架、超凈工作臺、移液器、DEPC處理過的槍頭、EP管等。 5×M-MLV RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase抑制劑(30U/μL)、M-MLV Reverse Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、無菌的DEPC水等。 四、實驗步驟 注意：戴......閱讀全文
RLMRACE法合成雙鏈cDNA
實驗概要掌握合成雙鏈cDNA的RLM-RACE技術，可構建高質量的cDNA文庫。主要試劑1.?酶類及分子量標準?? 1)? 高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列；?? 2)?Taq DNA Polymerase，上海申
cDNA第二鏈的合成方法
cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種：（1）自身引導法。合成的單鏈eDNA3’端能夠形成一短的發夾結構，這就為第二鏈的合成提供了現成的引物。當第一鏈合成反應產物的DNA—RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段或反轉錄酶合成eDNA第二鏈，最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環，
錨定酶消化cDNA實驗
試劑、試劑盒 溶液與緩沖液引物儀器、耗材 試劑盒MPC-EPCR儀Gene PulserII 型系統實驗步驟 實驗方案 A1.通過加入下列物質來消化雙鏈 cDNA2.在 37°C 下消化 lh。3.65°C 孵育 20 min 熱失活限制性酶。4.等體積 PCI 抽提后乙醇沉淀（實驗方案 A, 第
錨定酶消化cDNA實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 溶液與緩沖液 引物 儀器、耗材 試劑盒 MPC-E PCR儀
cDNA－擴增和影印實驗
實驗材料保存于細菌中的克隆純的、已測序確證的人 EST 序列試劑、試劑盒LB 培養基超級肉湯培養基乙醇裂解液RNA 酶溶液緩沖液乙醇 乙酸溶液丁二酸酐1－甲基－2－吡咯烷酮硼酸鈉儀器、耗材離心機96 孔熱循環儀水浴鍋微量滴定板清洗儀實驗步驟實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」1. 將密
錨定酶消化cDNA實驗
試劑、試劑盒溶液與緩沖液引物儀器、耗材試劑盒MPC-EPCR儀Gene PulserII 型系統實驗步驟實驗方案 A1.通過加入下列物質來消化雙鏈 cDNA2.在 37°C 下消化 lh。3.65°C 孵育 20 min 熱失活限制性酶。4.等體積 PCI 抽提后乙醇沉淀（實驗方案 A, 第 2 步
cDNA－擴增和影印實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 保存于細菌中的克隆純的、已測序確證的人 EST 序列 試劑、試劑盒
cDNA－擴增和影印實驗
實驗方法原理 實驗材料 保存于細菌中的克隆純的、已測序確證的人 EST 序列試劑、試劑盒 LB 培養基超級肉湯培養基乙醇裂解液RNA 酶溶液緩沖液乙醇 乙酸溶液丁二酸酐1－甲基－2－吡咯烷酮硼酸鈉儀器、耗材 離心機96 孔熱循環儀水浴鍋微量滴定板清洗儀實驗步驟 實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具
RNA的提取和cDNA合成（酸苯酚法）
內 容 提 要利用酸-苯酚法提取植物葉片中的RNA，并對其進行純化，最后利用反轉錄酶得到相應的cDNA，可用于以后的分子生物學操作。本實驗要求：1、掌握酸-苯酚法提取RNA的方法。2、了解RNA操作中的重要性。原 理從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二
PK120－cDNA－克隆實驗
實驗材料cDNA試劑、試劑盒Ready-To-Go DNA 標記試劑盒人肝臟 λgt11 cDNA 文庫人肝臟 λgt10 cDNA 文庫雜交溶液SSC 溶液pBluescript II SK 載體儀器、耗材PCR 擴增儀實驗步驟實驗所需「試劑」具體見「其他」1. 雜交反應抽提出的 50bp 的 P
PK120－cDNA－克隆實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 cDNA
PK120－cDNA－克隆實驗
實驗方法原理?實驗材料?cDNA試劑、試劑盒?Ready-To-Go DNA 標記試劑盒人肝臟 λgt11 cDNA 文庫人肝臟 λgt10 cDNA 文庫雜交溶液SSC 溶液pBluescript II SK 載體儀器、耗材?PCR 擴增儀實驗步驟?實驗所需「試劑」具體見「其他」1. 雜交反應抽提
關于cDNA第二鏈的合成方法介紹
（1）自身引導法。合成的單鏈eDNA3’端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物。當第一鏈合成反應產物的DNA—RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段或反轉錄酶合成eDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法
BioRad推出強勁的cDNA合成試劑盒
Bio-Rad公司近日推出了一款“高級”的cDNA合成試劑盒，適用于定量PCR前的cDNA合成。此款名為iScript Advanced cDNA synthesis kit的試劑盒能幫助研究人員生成更多的定量PCR數據，用于基因表達分析。 一般的逆轉錄試劑盒只能對1 μg總RNA進行
差減－cDNA－文庫的建立實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stra
差減－cDNA－文庫的建立實驗
實驗方法原理 實驗材料 ［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stratagene）試劑、試劑盒 TE 緩沖液EcoRI EDTA蔗糖溶液瓊脂糖凝膠TBE 緩沖液乙醇S1 核酸酶S1 核酸酶緩沖液苯酚 氯仿 異丙醇乙酸鈉AluIRsaI去離子甲醜胺SDS酵母 tRNA氯仿 異丙醇磷
差減－cDNA－文庫的建立實驗
差減文庫包含了存在于一種細胞或組織而不存在于另一種細胞或組織的 mRNA cDNA 克隆。這個 cDNA 文庫被用來分離相應于一類 mRNA 的一組 cDNA 克隆，或用 于分離一個特定mRNA 的 cDNA 克隆。這中間篩選 cDNA 克隆的過程是很費勞力的。來源：《精編分子生物學實驗指南（第五版
用隨機寡核苷酸引物從mRNA合成cDNA探針
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本方案以 poly(A) + RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA 文庫的差異篩選。 實驗材料
用隨機寡核苷酸引物從mRNA合成cDNA探針
實驗方法原理 本方案以 poly(A) + RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA 文庫的差異篩選。實驗材料 反轉錄酶反轉錄酶緩沖液隨機脫氧核苷酸引物模板 mRNA試劑、試劑盒 乙酸銨DTTEDTA乙醇HClNaOH酚氯仿胰 RNA 酶抑制劑SDS Tris
用隨機寡核苷酸引物從mRNA合成cDNA探針
本方案以 poly(A)?+?RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA 文庫的差異篩選。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。實驗方法原理本方案以 poly(A)?+?RNA 作為模板，通過隨機引物反應合成 cDNA 探針，這類探針可用于 cDNA
CDNA第一條鏈的合成－（20微升體系）
CDNA第一條鏈的合成 （20微升體系）一、??按以下順序加樣于500微升EP管中1. RNA 5 UL2. Oligo Dt 1 UL3. dNTP 1 UL (濃度10mM)4. DEPC水 5UL (為試劑盒中配套的水)共12UL混勻離心——70℃水浴5分鐘——冰浴2分鐘（片刻）二、??繼續按
cDNA
·?????????cDNA Synthesis?(Crawford Lab)mRNA can be converted into DNA (copy DNA, cDNA) by annealing oligo-dT to the 3' poly-A tail that occurs on
大規模－PCR－制作－cDNA－微陣列實驗
本方案描述了通過 PCR 擴增產物，來制作 cDNA 微陣列的實驗步驟。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒緩沖液、溶液和試劑生物分子酶和酶緩沖液核酸和寡核苷酸凝膠儀器、耗材專用設備實驗步驟第 1 階段：影印鋪板與工作庫的制備一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑羧芐
大規模－PCR－制作－cDNA－微陣列實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 緩沖液、溶液和試劑 生物分子 酶和酶緩沖液 核酸和寡核苷酸 凝膠 儀器、耗材
基于－PCR－的差減－cDNA－克隆實驗
差減克隆是分離和鑒定兩個細胞群中差異表達的 mRNA 的有效技術。相比較的細胞類型是［＋］（或 測 試）細胞和［-］（或驅動）細胞，在測試細胞中表達而不在驅動細胞中表達的 mRNA 將被分離出來。必需的差減次數主要取決于 cDNA 的多樣性。多樣性是指每一個細胞類型中不同的cDNA 或 cDNA 片
基于－PCR－的差減－cDNA－克隆實驗
實驗方法原理 實驗材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA）試劑、試劑盒 ALuIRsaIATPT4 多聚核苷酸激酶及其緩沖液DNA連接酶和及其緩沖液Taq DNA聚合酶及其緩沖液寡核苷酸引物4dNTP 混合物驅動 dNTP 混合物轉化感受態菌株HEPES緩沖液鏈霉親和素溶
基于－PCR－的差減－cDNA－克隆實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 實驗材料 A 和 B 類細胞的雙鏈 cDNA （ds cDNA） 試劑、試劑盒
用經典－RACE－擴增－cDNA－的5’末端實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 GSP-RT 引物 poly(A)+RNA 或總 RNA 反轉錄緩沖液 RNA 酶 H RNasin SuperScriptI
用經典－RACE－擴増－3末端－cDNA－實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 dNTP 溶液 二硫蘇糖醇 TE 反轉錄緩沖液 RNA 酶 H RNasin SuperScriptⅡ逆轉錄酶
用經典－RACE－擴増－3末端－cDNA－實驗
試劑、試劑盒?dNTP 溶液二硫蘇糖醇TE反轉錄緩沖液RNA 酶 HRNasinSuperScriptⅡ逆轉錄酶poly(A)+RNA 或總 RNAQT 引物Hercules Hot-Start 聚合酶儀器、耗材?水浴或加熱儀熱循環儀實驗步驟?試劑可以從多數大供應商那里買到該過程所需要的材料與合適的