CDNA第一條鏈的合成 （20微升體系）
一、 按以下順序加樣于500微升EP管中
1. RNA 5 UL
2. Oligo Dt 1 UL
3. dNTP 1 UL (濃度10mM)
4. DEPC水 5UL (為試劑盒中配套的水)
共12UL混勻離心——70℃水浴5分鐘——冰浴2分鐘（片刻）
二、 繼續按以下順序加樣
1. 5×BUFFER 4 UL
2. 0.1MDTT 2UL
3. RNase Out* 1UL
混勻——37℃ 2分鐘
三、再加M-MLV* 1 UL
共20UL 混勻37 60分鐘——70℃ 15分鐘
四、CDNA 合成完畢，4℃冰箱保存
“*”標識為反應酶，需現用現取，千萬不要長時間常溫放置，防止酶失活
五、普通RT-PCR 反應
PCR反應體系確定標準：
Mg2+ 1.5 mmol/L
Kcl 50 mmol/L
dNTPs 200umol/L
引物 1 umol/L
DNA聚合酶 1-5unit
模版DNA 1pg--1ug
1目的：驗證引物的正確性，為實時定量PCR做準備；若目的基因條帶清楚，無雜帶，可進一步制作目的基因標準曲線
2準備工作：根據引物不同，確定不同的反應體系，做好標記
3現以本人目的基因為例說明如下：
ETS、HGF、CMET、內參GAPDH
每一份CDNA樣品需分4管( PCR儀專用EP管)
⑴ ETS_1
⑵ HGF
⑶ CMET
⑷ GAPDH