熒光分光光度計結構與組成

一、組成

熒光分光光度計的基本組成部件包括：激發光源、單色器、樣品室、檢測器、顯示系統。

二、激發光源

光源提供激發樣品的激發光，常見的激發光源有高壓氙燈、高壓汞蒸氣燈、激光器、閃光燈等。高壓氙燈能發射出強度較大的連續光譜，且在300～400nm范圍內強度幾乎相等，成為目前應用最多的連續光源。高壓氙燈的外殼為石英玻璃，內部充壓力為5倍標準大氣壓的氙氣，工作時壓力可達到20倍標準大氣壓。以激光器作光源時，激發光強度大且單色性好，能極大地提高熒光分析的靈敏度。以激光器作為光源的高性能熒光儀可實現單分子檢測，但存在激發光一般為單波長，不能調整入射光的能量，且價格昂貴，使用上受限制的缺點。此外，目前商品儀器中應用較多的閃光燈有氫燈、氮燈、脈沖激光燈等類型。

三、單色器

單色器用來分離出所需要的單色光。早期的熒光計是以濾光片來分離單色光，現在熒光分光光度計中應用最廣的是光柵單色器。一般地，熒光分光光度計上裝有兩個單色器，激發單色器和發射單色器。置于光源和樣品室之間的為激發單色器，篩選出特定的激發光譜。置于樣品室和檢測器之間的為發射單色器，篩選出特定的發射光譜。單色器上有進、出光兩個狹縫，增大狹縫寬度則信號強度增強，減小狹縫寬度則分辨率增大。單色器的色散能力與雜散光水平是兩個重要的性能指標，比較理想的單色器應具有低雜散光，以減少雜散光對熒光測量的干擾，同時具有高色散能力，以便弱的熒光也可以被檢測到。現在某些型號的熒光分光光度計上采用了雙光柵單色器，入射雜散光大大減少了，然而儀器的靈敏度卻大幅降低。

四、樣品室

樣品室通常由石英池架(適于液體樣品用)或固體樣品架(適于粉末或片狀樣品)組成。測量液體樣品時，光源與樣品成直角安排；測量固體樣品時，光源與樣品成銳角安排。熒光儀上用的樣品池與紫外可見分光光度計上用的樣品池存在較大差異。紫外可見分光光度計上用的比色皿材質常為玻璃或石英，方形，兩面透光；而測熒光用的樣品池稱為熒光池，是用石英材質制成，形狀也為長方形或方形，但四面透光。低溫熒光測定時還需在熒光池的外面再套一個充液氮的透明石英真空瓶。

五、檢測器

檢測器的作用是將光信號放大并轉為電信號，一般用光電管或光電倍增管(PMT)作檢測器。在一定條件下，PMT的電流量與入射光強度成正比，它測量的數據是眾光子脈沖響應的平均值。加在PMT上的電壓越高，則其放大作用越大。但是，過大的電壓會造成PMT損壞，這點在實際使用中尤應注意。電荷耦合器件陣列檢測器(CCD)是近年來出現的一類新型的光學多通道檢測器，檢測光譜范圍寬、暗電流小、噪聲低、靈敏度高，可獲取彩色、三維圖像。因其價格比較昂貴，常用在高檔熒光儀上。

用PMT作檢測器時，有兩種不同的檢測方式：熒光光子計數型檢測與模擬型檢測。

(1)光子計數型PMT光子計數型PMT適用于待測樣品信號很弱、需取多次掃描平均值來提高信噪比的情況，其優點是具有較高的檢測靈敏度和穩定性，對每個光子所引起的陽極脈沖都進行檢測和計數，而且對施加于PMT上的高壓電的電壓波動不敏感，對放大器和高壓電的電源穩定性沒有要求。其缺點是不能通過改變PMT上的電壓來提高它的增益；光子計數也僅限定于線性的計數速度內。

(2)模擬型PMT模擬型檢測是取各個脈沖所貢獻的平均值，脈沖是否同時到達則無關緊要。其優點是能通過改變PMT上的電壓來提高它的增益，因此可在很大的信號強度范圍內檢測而不必考慮非線性響應。模擬型檢測器要求放大器和高壓電的電源都要相當穩定。

六、顯示系統

顯示系統由光度表、計算機操作系統等組成。

七、儀器工作過程

由光源發出的光經激發單色器變為單色光，照射在熒光池中的被測樣品上產生熒光；物質產生的熒光被發射單色器色散為單色光，經光電倍增管轉化為相應的電信號，再經放大器放大反饋到A／D轉換單元，模擬電信號即轉換成相應的數值，最后經顯示器或打印機記錄被測樣品的譜圖，此時記錄的譜圖即為發射光譜(emissionspectrum)，又稱為熒光光譜。這就是熒光分光光度計的基本工作過程。

八、分類

分子熒光分光光度計按單色器劃分為光柵單色器型與濾光片單色器型熒光分光光度計；按光學系統劃分為單光束熒光分光光度計和雙光束熒光分光光度計；按測量光譜的性質分為穩態熒光分光光度計與瞬態熒光分光光度計。現在的商品熒光分光光度計大多是單光束、光柵型儀器。