劉鋼團隊開發基因治療和疫苗載體快速定量檢測黑科技

【導語】基因治療或疫苗開發過程中，對AAV衣殼濃度進行完整、精確的測定，是前期研發，中期篩選中獲得可靠數據，后期治療中能夠安全有效給藥的必要條件。

基因療法能從根本上補充或修復缺陷基因，恢復健康基因的正常生物學功能，具有不可比擬的治療優勢。腺病毒或腺相關病毒 （AAV） 已經成為預防感染、嚴重疾病和死亡的理想基因治療和疫苗載體。 

載體進入體內誘導免疫反應并建立免疫記憶需要一種具有傳染性的活性病毒疫苗。傳統的定量檢測方法中，無論是靈敏度較高的qPCR檢測，還是傳統免疫學原理Elisa檢測等，僅可以定量病毒載體的總濃度。

因受到病毒載體碎片干擾，而無法精確測定病毒疫苗載體的效價濃度，進而影響基因藥物或疫苗的生產質量控制以及精準給藥。因此，迫切需要一種可準確測定病毒載體的濃度和存活力的新技術。 

近日，華中科技大學 劉鋼 教授團隊在 Materials Today Bio 期刊發表了題為： Versatile nanorobot hand biosensor for speci?c capture and ultrasensitive quanti?cation of viral nanoparticles  的研究論文。 

針對上述問題，華中科技大學劉鋼教授和黃麗萍博士團隊與華中農業大學金梅林教授、張強副教授團隊合作，研發了一種具有納米級多功能機器人手結構的納米等離子體 （Nano RHB） 生物傳感器，用于快速、無損和特異性地捕獲和定量檢測腺病毒顆粒。該傳感器可應用于實時監測基因治療和病毒疫苗載體數量和質量，評估病毒載體的感染活力。

在該研究中，研究人員首先開發了一種基于非常光透射 （EOT） 效應的無標記NanoSPR生物傳感器。該生物傳感器可以被非偏振光激發，并且不需要復雜的光學設備。然后通過在納米杯陣列芯片上直接實施金種子生長法，設計了一種具有納米機器人手的新型多功能NanoSPR生物傳感器。

由于其特殊的納米杯結構作為種子模板，通過聚多巴胺分子在芯片表面生成了不同形狀的分枝狀金納米結構。這些分支金納米結構的功能類似于智能機器人手，從而增強SPR共振效應以提高芯片的靈敏度，同時增加表面積以提高芯片修飾效率。將這些超靈敏生物傳感器集成到標準96孔板或32孔板中，可以直接監測動態結合曲線，并使用微量樣品定量檢測腺病毒載體或疫苗。

研究結果表明，基于該新型傳感器，將重組人CAR、FX蛋白或抗腺病毒六鄰體蛋白抗體固定在NanoRHB的表面，這些配體可以分別結合腺病毒的纖維蛋白 （病毒衣殼上突出的刺突） 和六鄰體蛋白 （主要的衣殼蛋白） ，通過腺病毒特異性結合的CAR/FX蛋白相互作用可快速檢測腺病毒的生存活力和濃度，在5分鐘內同時高通量檢測多達96個樣品，比傳統病毒滴度檢測方法和PCR方法更高效快捷。

此外，研究人員還使用凍干技術將CAR標記的金顆粒整合到單克隆抗體修飾的Nano RHB平臺上，檢測靈敏度可以進一步提高5倍。研究結果顯示，金顆粒偶聯的Nano RHB的獨特SPR效應可實現一步式夾心法進行高靈敏度和快速的腺病毒載體顆粒評估，而不需要洗滌步驟和復雜的樣品預處理。該種超靈敏金納米分支結構修飾的生物芯片，不僅可以快速有效地評估腺病毒載體的活力，還可以通過一步夾心法提高檢測靈敏度至100 copies/mL。

研究人員進一步將采用NanoRHB平臺檢測26個細胞上清液樣品，結果顯示與傳統qPCR和病毒滴度檢測分析的結果非常一致。Nano RHB傳感器分析顯著縮短了總檢測時間，從幾天和幾小時縮短到幾分鐘，并通過直接結合病毒表面蛋白來同時快速檢測病毒生存力和濃度，從而提高了檢測能力。該新型檢測平臺也展示出對不同類型的病毒載體和假病毒的高特異性。 

研究結果顯示Nano RHB平臺是一種有前途的高通量生物檢測工具，用于高效和超靈敏地評估疫苗和基因遞送載體，用于大規模腺病毒載體疫苗的快速質量控制，亦可用于其他基于病毒載體和基因載體的檢測分析。 

研究團隊已實現上述技術的轉化 ，基于NanoSPR技術開發的一種腺相關病毒 （AAV-2） 定量檢測試劑盒，能準確、快速、簡便、高通量的檢測細胞上清中AAV-2病毒含量。 AAV-2病毒定量檢測試劑盒的原理是AAV-2病毒上的衣殼蛋白和生物芯片表面AAV-2單抗結合后與芯片納米孔產生等離子共振效應，引起特定波長處吸光度的改變。該波長處的吸光度的高低與樣本中的AAV-2病毒含量成正比。故可利用已知濃度的病毒樣品在NanoSPR芯片的特定波長處的吸光度變化，建立吸光度變化值與濃度值的標準曲線，從而計算出待測樣本中的AAV-2病毒含量。

AAV作為基因治療的明星載體，是目前基因治療中最常用的載體，準確的滴度檢測是AAV基因治療藥物質控的重要組成部分，也是開展臨床研究的前提條件。 AAV-2病毒定量檢測試劑盒可搭配量準多功能分子檢測儀 （WeSPR 100或WeSPR HT96） 使用，一步加樣，15min即可出結果，能準確、快速、簡便、高通量的檢測細胞上清中AAV-2病毒含量。大大簡化了AAV開發者的工作流程。

在基因治療、抗病毒疫苗開發等領域有著非常廣泛的應用前景。基因治療或疫苗開發過程中，對AAV衣殼濃度進行完整、精確的測定，是前期研發，中期篩選中獲得可靠數據，后期治療中能夠安全有效給藥的必要條件。同時，測定AAV分離純化過程中不同階段的病毒濃度、優化克隆、提高產量也十分重要。 

華中科技大學博士生李睿、華中農業大學博士生趙亞、華中科技大學博士生樊洪利為論文的共同第一作者，華中科技大學的黃麗萍博士、劉鋼教授及華中農業大學的金梅林教授、張強副教授為該文的共同通訊作者。該工作得到了科技部國家重點研發計劃、國家自然科學基金委的資助。