WesternBlot的過程與優化，著重于化學發光檢測2

四、化學發光信號

4.1 信號捕捉

雖然化學發光蛋白質印跡法十分常用，但是對于難于捕獲的信號的捕捉卻很棘手。蛋白質印跡法要用到一系列需要技巧的技術，因此許多因素都會導致無法捕捉到信號。由于變量較多 (表 33. 2)，問題印跡的問題診斷和排除就如同大海撈針一樣困難。傳統的方案在檢測某一個蛋白質時通常都是無效的。例如 ， 一 抗可能無法識別變性狀態下的固定化抗原。盡管在非變性環境下蛋白質可保持天然狀態，但這卻使得目標蛋白質分子質量的確定更具挑戰。此外，超大型或疏水蛋白質通常會阻礙有效的膜轉移。另外，小型蛋白質 (小于等于 10 kDa) 會從膜孔中穿出，無法與膜結合。因此, 為確保能夠用于檢測靶物質，Towbin 的原始方案一再被修改。這些修改包括使用不同的試劑進行間接檢測或 4標記的一抗進行直接檢測。有時可以完全跳過轉移這一步驟，在凝膠內完成檢測（Desaiet al.,2001)。

體 持 續 時 間 取 決 于 所 使 用 的 特 定 底 物 。產 生 了 多 少 光 、這 些 光 能 持 續 多 久 , 則 取 決 于 具 體使 用 的 底 物 以 及 系 統 中 酶 與 底 物 之 間 的 比 例 。盡 管 用 于 一 個 印 跡 的 底 物 量 相 對 恒 定 ，呈現 的 酶 的 數 量 卻 和 添 加 量 以 及 其 他 因 素 有 關 (見 表 33.1)。在 蛋 白 質 印 跡 系 統 中 ，酶 聯 物過 多 是 導 致 信 號 易 變 、背 景 太 深 、信 號 持 續 時 間 短 及 靈 敏 度 低 的 單 一 的 最 主 要 的 原 因 。

最 理 想 的 信 號 發 射 曲 線 是 緩 慢 衰 減 的 (圖 33. 4 ) , 因 為 這 表 明 系 統 中 的 每 一 組 分 都 達到 了 最 優 化 ，并 能 產 生 可 重 復 的 結 果 。信 號 衰 減 的 太 快 會 造 成 差 異 ，使 得 靈 敏 度 低 及 信 號記 錄 不 足 。持 續 時 間 長 的 信 號 能 最 大 限 度 減 小 因 轉 移 效 率 、底 物 制 造 商 批 次 和 其 他 因 素造 成 的 差 異 。

雖 然 H R P 在 底 物 存 在 的 情 況 下 能 保 持 活 性 ，但 是 隨 著 和 底 物 接 觸 時 間 的 延 長 , H R P也 會 失 活 。在 氧 化 反 應 中 產 生 的 自 由 基 可 與 H R P 結 合 ，這 種 方 式 讓 酶 無 法 再 與 底 物 反應 。系 統 中 過 量 的 H R P 也 會 產 生 大 量 的 自 由 基 ，這增 加 了 H R P 失 活 的 可 能 性 。 自由基還 會 破 壞 抗 原 、抗 體 和 膜 ，降 低 膜 再 標 記 的 有 效 性 。

4.3 蛋 白 廣 印 跡 的 優 化

每 一 個 蛋 白 質 印 跡 系 統 都 必 須 經 過 優 化 以 獲 得 一 致 的 實 驗 結 果 。許 多 因 素 都 會 影 響信 號 的 強 度 和 持 續 時 間 , 每 一 種 因 素 都 可 被 優 化 , 我 們 將 在 以 下 幾 節 中 討 論 。本 章 末 尾 關于 方 案 的 一 節 包 括 了 優 化 步 驟 的 具 體 指 導 和 建 議 。

4.3.1 印跡膜

膜 組 分 似 乎 不 能 影 響 H R P -魯 米 諾 反 應 以 及 后 續 的 信 號 產 生 。然 而 ，硝 酸 纖 維 素 膜和 P V D F 膜 的 確 在 蛋 白 質 結 合 特 性 上 有 所 不 同 。一 般 來 說 ，硝 酸 纖 維 素 膜 能 更 好 地 與 蛋白 質 結 合 ，條 帶 更 清 晰 ，有 時 候 靈 敏 度 也 更 高 。而 P V D F 膜 疏 水 性 更 強 , 不 易 浸濕 ，有 時會 產 生 更 多 背 景 信 號 ，然 而 ，它 具 有 較 大 的 抗 張 強 度 和 良 好 的 操 縱 特 性 。為 獲 得 最 好 的 實驗 結 果 ，需 要 根 據 經 驗 來 確 定 蛋 白 質 印 跡 系 統 最 優 化 的 膜 類 型 、制 造 商 和 批 次 。一旦 證 明某 種 膜 在 系 統 中 有 效 ，最 好 在 整 個 研 究 過 程 中 都 使 用 這 一 批 次 的 產 品 。

4.3.2 靶蛋白

不 同 蛋 白 質 的 轉 移 效 率 有 著 很 大 不 同 。在 特 定 的 設 置 的 條 件 下 ，蛋 白 質 遷 出 凝 膠 的能 力 及 結 合 膜 的 向 有 所 不 同 。轉 移 效 率 依 賴 于 一 定 因 素 ，如 凝 膠 組 分 、凝 膠 與 膜 的 接 觸程 度 、電 極 的 位 置 、轉 移 的 持 續 時 間 、蛋 白 質 大 小 和 組 分 、電 場 強 度 及 是 否 加 人 去 污 劑 。低離 子 強 度 緩 沖 液 和 低 電 流 的 條 件 可 使 大 多 數 蛋 白 質 達 到 最 優 轉 移 。使 用 與 免 疫 印 跡 相 兼容 的 或 可 逆 的 染 料 對 膜 進 行 染 色 ，可 評 估 轉 移 效 率 (Sasse and Gallagher, 2008)。用 于 膜染 色 的 一 些 常 見 蛋 白 質 染 料 包 括 : 麗 春 紅 S ,— 種 可 隨 時 間 褪 色 的 紅 色 染 料 ; 考 馬 斯 染 料 ，一 種 可 緊 密 結 合 蛋 白 質 并 干 擾 免 疫 印 跡 的 敏 感 的 藍 色 染 料 ,— 種 簡 單 可 逆 的 藍 色 染 料（Antharavally et al. ，2004)。

4.3.3 封閉緩 沖 液

很 多 不 同 的 封 閉 試 劑 都 對 蛋 白 質 印 跡 有 效 。因 為 沒 有 任 何 一 種 封 閉 劑 適 用 于 所 有 系統 ，故 有 必 要 進 行 檢 驗 (Spinola and C a n n o n ，1985)。理 想 的 封 閉 緩 沖 液 具 有 最 大 的 信 噪比 ，而 且 不 會 與 系 統 中 的 抗 體 或 靶 物 質 反 應 。例 如 , 在 親 和 素 -生 物 素 系 統 中 使 用 5 % 脫脂 牛 奶 作 為 封 閉 劑 可 造 成 高 背 景 ，因 為 牛 奶 中 含 有 不 同 量 的 內 源 生 物 素 , 可 與 親 和 素 蛋 白結 合 。當 變 換 底 物 、抗 體 或 靶 物 質 時 ，僅 僅 因 為 對 于 這 一 新 系 統 封 閉 緩 沖 液 不 再 是 最 理 想的 , 就 可 能 引 起 信 號 減 弱 或 背 景 增 強 。

在 封 閉 緩 沖 液 中 加 人 表 面 活 性 劑 ，如 去 污 劑 T W e e n -20，可 為 某 些 系 統 帶 來 好 處 。表 面 活 性 劑 阻 止 封 閉 試 劑 與 靶 物 質 的 非 特 異 結 合 ，或 將 膜 上 抗 體 可 以 結 合 的 疏 水 位 點 封閉 , 從 而 使 背 景 最 弱 化 。然 而 ，加 入 過 多 的 去 污 劑 會 造 成 封 閉 不 充 分 。通 常 我 們 使 用 終 濃度 為 〇. 0 5 % 的 去 污 劑 。但 是 ，為 了 得 到 最 好 結 果 , 我 們 要 確 定 去 污 劑 是 否 增 強 了 某 個 特殊 系 統 及 確 定 去 污 劑 的 理 想 濃 度 。通 常 使 用 高 質 量 低 污 染 的 去 污 劑 。

4.3.4 抗體

不 只 是 作 用 于 抗 原 的 一 抗 的 親 和 力 很 重 要 , 一 抗 和 二 抗 濃 度 同 樣 對 信 號 強 度 有 很 大影 響 。一 抗 或 /和 二 抗 濃 度 不 當 會 造 成 印 跡 上 H R P 過 多 。采 用 最 小 一 抗 濃 度 比 較 有 利 ，因 為 這 樣 能 推 動 靶 物 質 的 特 殊 結 合 并 降 低 背 景 。

如 果 印 跡 不 能 產 生 足 夠 的 信 號 ，就 將 所 有 的 檢 測 試 劑 從 印 跡 中 移 除 (剝 離），并 使 用 不同 的 一 抗 或 不 同 的 抗 體 濃 度 重 新 標 記 ，這 種 做 法 常 常 可 以 節 約 珍 貴 的 樣 品 ，并 且 節 省 時間 ; 然 而 ，不 充 分 的 剝 離 可 使 有 活 性 的 H R P 殘 留 在 印 跡 上 并 產 生 信 號 。將 底 物 加 在 被 剝離 的 印 跡 上 , 隨 后 便 可 檢 測 出 印 跡 上 是 否 殘 留 活 性 H R P 。 同 樣 , 剝 離 無 法 移 除 的 大 量 失活 H R P 分 子 會 抑 制 一 抗 與 靶 物 質 的 結 合 。剝 離 并 重 新 標 記 印 跡 是 一 種 獲 得 特 殊 系 統 相關 信 息 的 有 效 方 法 ，但 并 不 是 一 種 確 定 理 想 系 統 參 數 的 決 定 性 方 式 。

4.3.5 檢 測 方 法

習 慣 上 ，使 用 膠 片 來 檢 測 蛋 白 質 印 跡 的 化 學 發 光 信 號 。它 不 需 要 昂 貴 的 設 備 ，并 能 提供 極 佳 的 靈 敏 度 ，但 卻 只 有 狹 窄 范 圍 的 線 性 檢 測 強 度 。通 常 需 要 調 整 膠 片 的 曝 光 時 間 以得 到 具 可 出 版 質 量 的 印 跡 結 果 ，這 會 消 耗 時 間 并 造 成 浪 費 。將 曝 光 后 的 膠 片 浸 泡 在Thermo Scientific Reagents 系 列 產 品 中 可 以 移 除 曝 光 過 度 產 生 的 額 外 信 號（圖 33.5 ) 。這 些 試 劑 可 以 均 勻 地 移 除 膠 片 中 的 銀 ，在 優 化 膠 片 表 觀 的 同 時 維 持 信 噪 比 。

C C D 照 相 機 及 附 帶 的 分 析 軟 件 可 以 調 整 背 景 水 平 并 完 成 密 度 測 定 。與 膠 片 相 比 ，成像 儀 在 檢 測 方 面 具 有 一 定 優 勢 ，因 其 有 較 大 的 動 態 范 圍 和 高 程 度 的 曝 光 控 制 ，可 在 沒 有 高背 景 或 高 強 度 信 號 干 擾 數 據 的 情 況 下 盡 可 能 地 完 成 圖 像 記 錄 。此 外 , 理 想 的 曝 光 時 間 可防 止 條 帶 信 號 飽 和 , 并 能 觀 察 到 密 度 的 微 小 變 化 。相 比 較 而 言 ，膠 片 具 有 較 小 的 動 態 范圍 ，條 帶 信 號 也 會 迅 速 達 到 飽 和 。當 信 號 強 度 較 高 時 ，膠 片 的 低 動 態 范 圍 使 其 快 速 飽 和 ，并 且 曝 光 控 制 的 局 限 性 通 常 會 產 生 過 度 曝 光 的 圖 像 。

五、常見問題及其原因

5.1 沒 有 信 號

初 次 曝 光 時 未 捕 獲 到 化 學 發 光 信 號 , 表 明 該 蛋 白 質 印 跡 系 統 需 要 優 化 。通 常 , 信 號 缺失 由 系 統 中 酶 量 (即 HRP) 過 多 造 成 。當 信 號 不 能 被 檢 測 到 時 ，采 用 更 少 量 的 酶 聯 物 似 乎有 違 我 們 的 直 覺 。然 而 ，若 要 得 到 成 功 的 信 號 記 錄 ，酶 和 底 物 量 的 恰 當 平 衡 是 必 要 的 。酶催 化 的 底 物 氧 化 是 不 可 逆 的 ，因 此 , 一 旦 底 物 被 氧 化 , 就 不 能 再 與 酶 反 應 而 發 光 。 因 為 酶活性持續存在，底物就成了限制性因素，并且一旦底物耗盡，信號輸出就終止了。在活性酶量不足的情況下發生信號缺失是很少見的。蛋白質印跡系統中的任何因素都會造成酶量過多或不足。

為了產生能夠被捕獲的信號，需要調整系統參數。制備新凝膠并使用較少樣品或滴定抗體能獲得可重復的結果。當優化抗體濃度時，需要對印跡成像兩次: 第一次在加人底物后立即進行; 第二次在孵育底物一段時間后（如 I h ) 進行。第二次檢測能提供理想酶濃度的相關信息，并有助于優化參數。

并且，如果初次曝光未捕獲到信號，則在底物中進行二次孵育可能會產生信號 (若一些 H R P 仍有活性）。將所有的檢測試劑從印跡中剝離并再標記印跡可以在優化參數的同時節省珍貴的樣品。在底物中進行一次額外的孵育并剝離印跡僅僅只能再次獲取系統的一些相關信息。如果想要了解印跡與印跡之間的一致性和對比性, 就必須在每一次實驗中采用相同的條件和相同的步驟。

5.2 信 號 快 速 消 失

當一個特定系統產生的化學發光信號會快速消失時，需要根據前述方法對蛋白質印跡系統做一些優化。好消息是可以獲得信號，表明此次印跡已經有所優化。有些時候盡管所有的參數都是相同的，但特定系統依然會產生比通常消失得更快的信號。系統全面優化后會將這一類型的結果最小化。原方法經內部的輕微改動，就能得到雖不是最優化但卻也能獲得成功的系統，如轉移效率以及在保存和操作過程中樣品及抗體活性的改變。

5.3 背 景 過 強

產生高背景信號的原因可能是封閉不充分, 抗體與封閉蛋白質發生了交叉反應，或是使用了過量的酶聯物。有時研究人員認為某種特定的底物能產生背景或增強背景。這種底物通常在酶不存在時自身無法產生信號。當使用比先前更為敏感的底物時，如果不調整參數以補償底物靈敏度，就會產生高背景。采用最適濃度的抗體將會促進其對靶蛋白的特異結合并產生低背景。

5.4 新 的 底 物 無 法 產 生 信 號

有時 ，某個特定系統中唯一發生改變的變量為一瓶新的或批號不同的底物時，可能無法捕獲到信號。通常 ，該結果是由尚未完全優化的蛋白質印跡系統造成的。蛋白質印跡的底物本身就是可變的。許多制造商僅僅控制最小靈敏度，這使得新底物可能比先前使用的批次的更加敏感。在全面優化的印跡系統中, 底物敏感度的變化和其他的變量一樣，都是微小或不顯著的。

5.5 膜 上 呈 現 棕 色 或 黃 色 條 帶

當 H R P 被氧化和失活時會呈現棕色。一定量的酶聯物中，總是會有一部分被氧化。在優化后的系統中，被 氧 化 的 H R P 的量極小并無法從印跡上觀察到。黃色或棕色條帶的出現表明有大量的 H R P 存 在 ，因而被氧化和失活的部分是可見的。會產生黃色帶的印 跡 系 統 需 要 通 過 可 采 用 更 少 量 的 酶 聯 物 進 行 優 化 。此 外 ，過 多 H R P 在 某 一 局 部 位置 時 ，則 會 在 酶 活 作 用 下 產 生 大 量 自 由 基 。 自 由 基 會 使 H R P 失 活 ，并 破 壞 抗 體 、靶 抗 原
和 膜 ，抑 制 有 效 的 再 標 記 。

5.6 條 帶 或 整 個 印 跡 在 暗 室 發 光

若 底 物 孵 育 后 的 條 帶 或 整 個 印 跡 發 光 ，可 認 為 系 統 中 存 在 過 多 的 H R P 。該 現 象 表 明H R P 連 接 的 二 抗 需 要 進 一 步 稀 釋 ，并 且 可 能 的 話 一 抗 也 要 稀 釋 。蛋 白 質 印 跡 系 統 中 涉 及的 許 多 因 素 都 可 以 引 起 酶 量 過 多 。若 整 個 印 跡 都 在 發 光 ，那 就 很 有 必 要 對 封 閉 和 清 洗 也進 行 優 化 。

5 .7 假 帶 / 空心帶

那 些 成 暈 輪 狀 (條 帶 中 間 無 信 號 ) 或 黑 色 背 景 下 整 個 條 帶 都 顯 白 色 的 蛋 白 質 條 帶 通 常被 稱 為 假 帶 。 白 色 區 域 內 底 物 耗 盡 時 就 會 導 致 這 一 結 果 的 發 生 。

我 們 并 不 明 確 假 帶 產 生 的 特 殊 原 因 。因 此 ，我 們 檢 測 了 幾 種 能 夠 造 成 這 一 結 果 的 因素 。我 們 會 在 下 面 章 節 中 簡 要 描 述 研 究 結 果 , 下 述 章 節 會 反 映 一 些 常 見 引 起 假 帶 效 果 的原 因 ，包 括 在 凝 膠 中 加 人 了 過 多 的 靶 蛋 白 ，以 及 使 用 了 會 與 封 閉 液 組 分 發 生 交 叉 反 應 的 抗體（V a t t e m and M a t h r u b u t h a m ,2005)。

5.7.1 分析方法

間 的 底 物 孵 育 會 延 長 信 號 持 續 時 間 。使 用 W e s t P i c o 或 W e s t D u r a 底 物 能 檢 測 到 低 至10 n g 的 蛋 白 質 , 甚 至 在 完 成 蛋 白 質 印 跡 的 64 h 后 依 然 可 以 檢 測 到 信 號 。 W e s t D u r a 比W est P ic o 的 底 物 更 敏 感 和 持 久 。盡 管 W e s t D u r a 在 檢 測 5 n g 蛋 白 質 時 能 產 生 極 強 信號, 但泳道中含量超過 100 n g 會 導 致 信 號 迅 速 消 失 ，這 強 調 了 局 靈 敏 度 檢 測 系 統 下 米 用適 量 靶 蛋 白 的 重 要 性 。

通 常 用 脫 脂 牛 奶 溶 液 孵 育 印 跡 以 最 小 化 背 景 信 號 。改 變 封 閉 液 中 牛 奶 的 濃 度 不 會 產生 假 帶 。 令 人 吃 驚 的 是 ，封 閉 液 中 含 0 . 5 % 脫 脂 牛 奶 可 以 增 強 低 豐 度 蛋 白 質 的 檢 測(圖 33. 7A ); 然 而 ，抗 體 同 封 閉 蛋 白 質 的 交 叉 反 應 確 實 會 引 起 假 帶 。如 果 一 抗 或 二 抗 同牛 奶 蛋 白 質 相 結 合 ，這 些 封 閉 的 位 點 化 學 發 光 ，產 生 深 色 背 景 ，而 樣 品 蛋 白 質 集 中 于 膜 表面 ，形 成 白 色 條 帶 (圖 33. 7B )。

高 濃 度 的 酶 聯 二 抗 與 大 量 靶 蛋 白 結 合 時 會 增 強 底 物 的 催 化 作 用 ，從 而 導 致 信 號 迅 速消 失 ，使 這 些 區 域 內 的 底 物 迅 速 耗 盡 。膜 上 轉 移 的 大 量 蛋 白 質 可 與 大 量 H R P 連 接 的 二抗 相 結 合 。這 些 免 疫 復 合 物 集 中 區 域 內 產 物（也 就 是 信 號）的 過 度 產 生 會 使 底 物 迅 速 耗盡 ，造 成 假 帶 。總 之 ，凝 膠 過 量 上 樣 、二 抗 濃 度 過 高 、底 物 孵 育 未 達 到 最 優 化 的 時 間 ，以及抗 體 與 封 閉 區 的 交 叉 反 應 均 可 引 起 假 帶 。在 使 用 髙 靈 敏 度 檢 測 系 統 時 ，優 化 蛋 白 質 印 跡參 數 對 于 防 止 假 帶 的 產 生 是 極 其 至 關 重 要 的