實驗方法原理
Universal Linkage System(ULS?;KREATECH Biotechnology BV）是用鉑染色絡合物與鳥嘌呤核苷的N7殘基反應進行標記的方法。反應使核酸與鉑熒光基團之間形成穩定的化學鍵。依據反應條件，ULS化合物在較低的程度上也與腺嘌呤形成絡合物。該方法已用于DNA(包括質粒，黏粒，分子質量參考物，在低熔點瓊脂糖中的DNA、BAC、PAC、YAC，全染色體文庫，DOP-PCR產物，如衛星、著絲粒和端粒DNA的高度重復序列）、RNA、PNA、寡聚核苷酸和擴增的核酸產物。在Molecular Probes公司（Eugene，OR)同樣提供ULS試劑和試劑盒。
用任何ULS化合物進行標記的模板大小必須小于1000bp。大于1000bp的模板通常會產生大量的點狀背景。PCR產物一般小于1000bp，因此可直接進行標記。下面將要闡述的兩種DNA破碎方法—超聲破碎和酶切均可以用于Kreatech和Molecular Probes的操作步驟。Molecular Probes用Alexa—ULS拭劑時推薦用另一DNA酶I操作程序。操作步驟和相應的試劑是Molecular Probes提供的ULS標記試劑盒的一部分.
實驗材料 DNA樣品
實驗步驟
1DNA破碎
1.1超聲破碎
1.用TE制備DNA溶液（20ng/μL)，最好用至少100μLDNA溶液進行超聲破碎。
2.將樣品放在冰上，用一個小的錐形底塑料管進行3個循環、每次循環1min的超聲破碎DNA。選擇超聲破碎儀的功率水平和工作循環數，盡量使用最高的功率、盡量少的空泡形成。在破碎前和每個循環之后均將DNA溶液放在冰上1min預冷。在第二個和第三個循環前用微型離心機的最高轉速離心DNA溶液5s，使全部溶液落至管底。
3.取部分DNA溶液在1%的瓊脂糖凝膠上電泳確定DNA大小是否合適。
4.開始進行標記程序。
1.2DNA酶處理
1.制備DNA酶I的儲存液：用1mL 5mmol/L乙酸鈉、1mmol/LCaCl2、50%甘油pH5.2溶解1mgDNA酶I(大約2000U/mg，Roche公司)。在加凍干的DNA酶之前和期間，緩沖液均放置在冰上。上下翻轉溶液直至完全混勻，不能振蕩，儲存液保存在-20℃條件下并盡量避免反復凍融。
2.用1X缺口平移緩沖液稀釋DNA酶儲存液，稀釋比例為1:500
3.在冰上將下列成分加到小離心管中：1μL模板DNA、2.5μL 10X缺口平移緩沖液、3?5μL稀釋的DNA酶I，加水至25μL。
4.將上述小離心管置37℃溫育、10min。
5.將小離心管放在冰上終止反應。
6.在上述反應物中加入1/4體積的10mmol/L乙酸銨和2.5倍體積的無水乙醇進行沉淀。
7.用適當體積的標記溶液重懸沉淀。
8.取部分DNA溶液在1%的瓊脂糖凝膠上電泳確定DNA大小是否合適
2標記
2.1KREATECH推薦的操作程序
當ULS試劑與核酸以1:1比例（如IUULS試劑：1μgDNA)混合，可獲得合適的標記效率。當標記的核酸量不是標準的1μg時，核酸與ULS試劑的比例必須保證1:1。當標記的核酸量少時，應該至少100ng、20μL體積。另外，標記較大的核酸量，不應超過20μL中10μg核酸。只有模板濃度不低于5ng/μL可以用較大體積進行標記，ULS試劑量隨著加入的模板量進行調整。如果模板稀釋度太大，可以不加標記溶液。
1.在1μg模板中加入1U(2μL）ULS試劑。
2.用標記溶液將體積調至20μL，混勻。
3.在65℃條件下溫育15min。
4.稍離心。
5.用離心柱純化探針。
2.2Molecular Probes公司推薦的操作程序
Molecular Probes公司提供應用ULS標記系統結合各種染料的試劑盒。該試劑盒包括破碎DNA和標記探針所用的各種試劑。除了以下幾項外，標記操作程序和注意事項基本相同。
1.在標記前，Molecular Probes的ULS染料試劑依據選擇的染料溶于不同的緩沖液中。有一個圖表提供了與各個染料相關的所有特定信息。
2.標記前，DNA在95℃變性5min，然后在冰上快速冷卻。請注意：變性不是必需的步驟，但可以提高標記效率20%?40%。
3.標記反應物體積是25μL。
4.在80℃溫育15min。
5.MolecularProbes聲明：由于該公司ULS試劑結合的自有染料的特異性，對以前Kreatech提供的操作步驟已經做了修改
注意事項
1.超聲破碎時，樣品體積、裝樣品的容器種類、超聲破碎的時間和循環數、超聲破碎儀功率水平和工作循環均依據超聲破碎儀生產廠家、型號和探針而不同。為獲得大小合適的核酸片段有時需要進行一些預實驗。
2.進行DNA酶I消化時，所有的試劑均應放在冰上。用前臨時配制溶液。
3.DNA在標記前應進行純化，去除蛋白質、RNA和游離核苷酸。
4.應盡量避免高濃度Tris(>40mmol/L)或EDTA(﹥5mmol/L)、乙酸鎂（>100mmol/L)、NaCl(>100mmol/L)和限制性內切核酸酶消化緩沖液，因為這些對標記反應有限速效應。