T7RNA聚合酶具有高度啟動子專一性，且只會轉錄T7噬菌體中位于T7啟動子下游的的DNA或DNA復制品。
此酶在合成RNA的過程中，需要DNA模板與鎂離子（Mg2+）作為輔因子。牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）及精胺（spermidine）對此酶具促進效果。與細菌的RNA聚合酶的差異之一，在于T7RNA聚合酶不受抗生素立泛霉素（rifampicin）抑制。
