S1核酸酶的單鏈水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區,并從單鏈部位切斷核酸分子,而且這種單鏈區可以小到只有一個堿基對的程度。由于具備這種功能,使S1核酸酶在分析核酸雜交分子(RNA-DNA)的結構、給RNA分子定位、測定真核基因中間隔子序列的位置、去除DNA片段中突出的單鏈尾,以及打開在雙鏈cDNA合成期間形成的發夾環起作用。