RTPCR經驗之我談

看到論壇上有很多朋友詢問RT-PCR的重復性問題，說明這里面還是有很多問題的，于是 想跟大家分享一下自己做PCR的經驗：

1. 總RNA的提取： 材料來源一般為細胞和組織，細胞相對比較單一，蛋白污染較小，TRIZOL法提取結果 A260/A280 結果一般都在1.8-2.1之間；組織的成分較復雜，污染多，提取較純的RNA有一定難度, 我覺得以下地方需注意：
1）最好新鮮取材，不能馬上做的標本可以-70度保存，短時間內也不會有什么影響。
2）研磨的手法一定要正確，如果不能徹底把組織研碎（肉眼觀看無顆粒），很可能會影響你RNA的濃度，50-100mg的組織提取的RNA用20ul水稀釋后應該有2-4ug/ul 的濃度，當然最好在冰上研磨，這樣可以防止RNA的降解，但是我在常溫下做，好像濃度也不差。
3）加氯坊離心后上清不能吸太多，寧缺勿濫，一般吸上清的1/2,最好不超過2/3 ，我一般吸200-300ul 覺得就可以了。

其實RT-PCR對RNA的要求不是很高的，電泳不能跑出兩條帶也沒關系，逆轉錄后照樣可以p出來，因為PCR還是相當靈敏的，很少的模板鏈就可以了，所以只要RNA降解得不是太厲害就沒關系。這樣的RNA應該可以往下做： A260在 0.1-1.4之間 ，A260/A280 在1.7-2.0 之間，濃度在 1.5-5.0之間。

2.逆轉錄。 逆轉錄的技術我覺得較成熟，一般的mRNA加oligo（dt）和逆轉錄酶都可以做出來，我用小公司的試劑盒做都比較穩定，更不用說invitrogen和TAKARA等大公司了。

3. PCR . 這是個很精細的體系，酶 ， dNTP ，Mg的濃度適中才能達到最好的效果，有人說PCR不能像炒菜那樣，喜歡多放點鹽就多放點，喜歡多放點油就多放點，PCR對成分很在乎，這就是PCR難重復的原因，如果總體系少于25ul ，各種成分的量就更不好控制，因為0.3ul ，0.5ul ，本身加樣的時候誤差就很大，所以少于25ul的體系就難重復了。
1) 模板cDNA ，20ul 的逆轉錄體系取1-2ul足夠，我一般取2ul。
2）dNTP ，標準的PCR體系有dNTP的濃度，換算過來加上所需的體積。
3）Taq 酶 ，50ul的總體系加1ul足夠。
4）buffer ，有些buffer里含有Mg離子，自己換算一下，讓最后的Mg離子濃度能在1.5左右。
5）不含Mg的buffer要單加Mg
6）上下游引物 ，一般自己把引物公司合成的引物稀釋成10pmol/ul，1-2ul即可，因為標準的PCR體系需要10-100pmol 。
7）余下成分用水補平。

本人覺得影響pcr最大的因素是： Mg 濃度，退火溫度 ，循環數 ，其中Mg濃度為重中之重，有時候甚至有點苛刻， 濃度過高抑制taq酶，過低taq酶沒用，就像那個誰形容的美女，多一分則太肥,少一分又太瘦 。所以建議做個梯度 ，找到最適濃度。 退火溫度嘛，應該好摸，一般的實驗室都有梯度PCR儀的，至于循環數 ，30-40個，試情況自己定。 這些東西關鍵是自己摸，多摸幾個，不用十八摸那么夸張，七八摸應該就可以出來了。

純屬個人觀點，希望對大家有點幫助，并歡迎指正。