一、知識背景：
1. 基因表達：DNA——RNA——Protein
單拷貝基因表達存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因——104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白）——共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達水平對于其功能水平的調控是非常重要的。
2. PCR技術(Polymerase chain reaction)：
即聚合酶鏈式反應。
在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應分三步：
A.變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；
B.退火：將反應混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結合。
C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ —— 3’方向延伸。
以上三步為一個循環，如此反復。
3. 逆轉錄酶和RT-PCR
逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：
(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；
(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；
(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.
二、RT-PCR的準備：
1. 引物的設計及其原則：
(1)引物的特異性決定PCR反應特異性。因此引物設計是否合理對于整個實驗有著至關重要的影響。
在引物設計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內含子的引物，或者在目的蛋白表達過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內含子。
(2)引物設計原則的把握：引物設計原則包括:
a.引物長度:一般為15～30 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應的特異性。
b.堿基分布：四種堿基最好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續出現3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必須與模板嚴格互補，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。末位堿基是A時錯配的引發效率最低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續出現兩個以上的T。
d.引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會自身折疊成發夾狀結構或引物自身復性。
e.引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4個連續堿基互補，3’端不應超過2個。
f.同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續8個的互補堿基存在。
g.5’端無嚴格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產物的末端結合穩定。還可以進行特異修飾（標記、酶切位點等）等等。
根據實驗目的選擇適當的引物。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。
2. 耗材：
實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。
3. 試劑準備：
變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經DEPC處理并高壓的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中從細胞分離的RNA的質量至關重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩定，分布廣泛，除細胞內源性RNA酶外，環境中也存在大量RNA酶。
因此在提取RNA時，應盡量創造一個無RNA酶的環境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質變性劑如異硫氰酸胍抑制內源性RNA酶。
RT－PCR步驟：
1、RNA的提取：
2、cDNA的合成：
逆轉錄體系的組成：
3、PCR擴增：
50ul PCR體系的組成：
4、PCR反應條件：
四、PCR條件的優化：
PCR條件的優化主要是
①引物退火溫度的調節，一般在引物設計軟件推薦溫度的上下2 ℃變化尋找最佳退火溫度。
②此外Mg2＋濃度的調節也非常重要，通常最佳濃度為2 mM左右。
③引物和模板的量等。
五、產物的電泳和結果的測定：
根據產物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長度產物所需凝膠濃度），取適量PCR產物，加上樣緩沖液充分混合，點樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統成像分析。
分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度
六、需注意的問題：
1. 注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠（EB）、酚、異硫氰酸胍、紫外線等。
2. 注意避免試劑污染。
3. 始終注意避免RNA酶的污染。
4. 保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協調，注意實驗室衛生。