Prime95B背照式sCMOS在單分子定位超分辨顯微成像中的應用

在前幾期成像技術專題中我們向大家介紹了單分子定位超分辨顯微成像，并介紹了最適合這一應用的科學相機——背照式 sCMOS 相機 Prime 95B。可能大家心里還是有些疑慮：背照式 sCMOS 真的能夠取代 EMCCD 么？信噪比能夠達到要求么？

首先，讓我們再來復習一下什么是信噪比，還是熟悉的配方：

注：此處的信號為光子數

對于EMCCD來說，電子倍增過程會引入額外噪聲因子，這使得除讀出噪聲以外的其他噪聲都會被放大√2倍。因此EMCCD信噪比的計算公式變為：

以看到，雖然電子倍增放大了信號，相當于降低了讀出噪聲，但是，其實散粒噪聲才是大多數時候決定信噪比的關鍵，它的大小是信號的平方根，當我們忽略其他噪聲時：

額外噪聲因子的存在相當于將相機量子效率減半！真是成也蕭何，敗也蕭何。

而對于背照式sCMOS來說，既具有和EMCCD相同的95%量子效率，也不存在額外噪聲因子，讀出噪聲又達到了相當低的水平（1.5個電子左右），信噪比在大多數情況下都要高于EMCCD。通過上面公式計算，當信號強度大于5個電子的時候，背照式sCMOS的信噪比就已經超越EMCCD了。更不要說EMCCD還有增益衰減等問題。

接下來我們就來對兩者的成像效果進行直觀比較，看看Prime 95B 是否真的能夠戰勝EMCCD。

Prime 95B vs EMCCD

韓國高麗大學的Shim研究組受邀對Prime 95B和 1024x1024 EMCCD 在DNA-PAINT實驗中的成像效果進行了比較（圖1）。他們使用具有預定義熒光圖案的DNA納米結構 Gattapaint80（ATto655標記，由 Gattaquant 提供）作為標準樣品，每個結構選取三個定位點，間隔為80nm；使用647nm激發光，強度約為2kw/cm2，TIR照明，曝光時間20ms，采集超過30000幀圖像。

圖1 EMCCD（1024x1024）和Prime 95B成像效果對比。兩者放大倍數分別為150x和100x ，相機幀率均為50fps。

通過計算，1024x1024 EMCCD的平均定位精度為13.29 nm，而Prime 95B的平均定位精度為9.24 nm，提高了30%。定位精度的模式也顯示出相當大的差異，分別為11nm與6nm。

另一位用戶對 Prime 95B 與 512x512 EMCCD 進行了比較（圖2）：使用Alexa647標記的Gatta Storm 50R納米尺，每個結構選取兩個定位點，間隔50nm；635nm激發光，曝光時間100 ms，采集超過10000幀。

圖2 EMCCD（512x512）和Prime 95B成像效果對比。兩者均采用100倍放大，EM gain=175；相機幀率均為10fps。

計算得出512x512 EMCCD的平均定位精度為17.98 nm，而Prime 95B的平均定位精度為13.38 nm，提高了25%。定位精度的模式分別為15 nm與12.5 nm

PrimeEnhance Off vs On

上期我們還介紹了Prime系列相機內置的PrimeEnhance功能可以提高圖像信噪比。因此Shim研究組也比較了開啟 PrimeEnhance 功能前后，Prime 95B的成像效果（圖3）

我們看到，當使用 PrimeEnhance 時，定位圖像中會出現一些不需要的背景噪聲信號（用黃色箭頭標記）。通過將分析軟件中的強度閾值提高2倍，可以消除這些信號（圖4）。

我們還可以從圖像直方圖分布上看到，開啟PrimeEnhance之后，直方圖上出現一些細長的“尾巴”，也就是圖像偽影，當強度閾值增加2倍時，這些偽影明顯被去除（圖5）。由此得到的平均定位精度從最初的 9.24 nm增加到 7.47nm，又增加了20%。這表明打開 PrimeEnhance 功能可以進一步提高 Prime 95B 的定位精度。

需要注意的是，當曝光時間為20ms時，啟用 PrimeEnhance 會將采集速度降低約40%，但這種差異可以通過使用100ms曝光時間來消除。

根據以上和來自其他許多用戶的數據，Prime 95B 以其近乎完美的靈敏度和更優化的像元尺寸，在各種單分子成像中都戰勝了EMCCD。而且還具有速度和視野上的巨大優勢。此外，Prime 95B內置的處理功能讓您在成像時如虎添翼：PrimeEnhance可以進一步提高您的圖像質量，從而提高定位精度；PrimeLocate幫您減少每幀采集的數據，減少存儲空間，加快數據處理速度。可以說，對于PALM，STORM等單分子定位超分辨顯微成像技術來說，Prime 95B是目前最優的選擇。

您可以通過下面鏈接閱讀我們在世界各地獲得的Prime 95B用戶反饋：

Prime 95B應用| 單分子&超分辨成像
Prime 95B應用| 超分辨成像
STORM 超分辨顯微成像 – Prime 95B 應用
光子學&STROM顯微成像——Prime 95B應用
單分子追蹤PALM——Prime 95B 應用
超分辨顯微成像——Prime 95B 應用

References

GATTAquant (http://www.gattaquant.com/) for providing the DNA-origami nanostructures.

Abbelight (https://www.abbelight.com/) for providing the imaging buffer.

ThunderSTORM (https://zitmen.github.io/thunderstorm/) which was used to reconstruct and visualize the data.

The Shim Group at Korea University (http://sodaus.wixsite.com/shimku)