PCRSSP法在HLAB27檢測中的應用

人類白細胞抗原B27（HLA-B27），是診斷強直性脊柱炎的指標之一，對強直性脊柱炎的早期診斷和預后以及對類風濕關節炎的鑒別診斷起著極其重要的作用。以前國內大多采用血清學方法對HLA-B27進行檢測，近來國內外有報道應用PCR技術對HLA-B27進行檢測，具有簡便快速，靈敏度高，特異性好，準確等特點。2001年3-6月，我科對全部進行HLA-B27檢測的病人運用PCR-SSP法進行檢測的同時，也進行了血清學檢測，現報告如下：

1. 材料與方法

1.   1材料

1.1.1引物特異性引物有2個。B27引物序列為：P_{1 5}¹-CAG,TCT,GTG,CCT,TGG,CGT,TGC;P₂5¹-GGC,TAC,GTG,GAC,ACG,CT.PC產物為144bp.5¹-TCA,CGG,ATT,TCT,GTT,GTG,TTT,PCR產物429 bp.以上引物由美國G&T Biotecli公司提供。

1.1. 2臨床樣本  181份來源于臨床進行HLA-B27檢測的患者。

1.1. 3PCR擴增儀  購自上海復星公司,型號PTC-100。

1.1.4電泳儀  上海西巴斯生物技術公司研制,型號DY-A。

1.1. 5HLA-B27分型血清板  由廣州醫學院神經研究所提供,含陰陽性對照。

 1.1. 6倒置顯微鏡  日本奧林巴斯光學儀器有限公司研制的CK-2。

1.2. 方法

1.2.1摸擬DNA提取 取EDTA抗凝靜脈血0.3ml 采用快速酚氯仿抽提DNA。

1.2.2PCR擴增PCR反應體至25μl，其中B27引物2μmol/L，  

內對照物1μmol/L,Mgcl2 2mmol/L 17.5mmol/Ltric,Kcl37.5mmol/L,

DNTP200μmol/L,5%Dmso,Taq酶0.5μ模板DNA22.5μl。

1.2.3擴增條件  95攝氏度變性5分鐘，然后95攝氏度30秒，60攝氏度30秒，72攝氏度90秒共30個循環。

1.2.4PCR產物檢測  以2%瓊脂糖（含0.5μg/ml溴乙錠），0.5XTEB電泳20分鐘（5V/CM），紫外燈下觀察結果。

1.2.5血清學分型  按標準微量淋巴細胞毒試驗進行。

2結果用PCR-SSP法對HLA-B27分型全部成功，無假陽性及假陰性，其中陽性42名，占23.2%，陰性139名，占76.8%診斷為強直性脊柱炎的患者陽性例數為38，陽性例數34名，陽性率89.5%，可疑強直性脊柱炎的患者陽性例數11，陽性例數2，陽性率18.2%。證明HLA-B27基因與強直性脊柱炎呈強相關。

 　　表1  PCR-SSP法檢測HLA-B27結果               　　

    血清學方法對HLA-B27檢測結果基本與PCR-SSP法相符，用血清學方法及PCR-SSP重復檢測，證實1例為假陽性，1例為假陰性。

     　　 表2  血清學法檢測HLA-B27結果 　　　　　           

3討論對HLA-B27基因的檢測，傳統上大多采用血清學方法，即檢測細胞表面的B27抗原，影響因素較多，易造成分析結果錯誤，我們對181例患者用血清學方法進行HLA-B27定型，其中1例假陽性，疑是抗原交叉反應以及操作過程中孔間的交叉污染造成，而1例假陰性，則考慮可能是抗體和補體在運輸及保存過程中效體下降所致。PCR-SSP法在基因水平對HLA-B27進行檢測，操作簡便，影響因素相對較少，靈敏度高，特異性好，無假陽性，假陰性現象，較之血清學方法，適用于臨床。

4參考文獻

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