PCRSSP分析實驗原理和步驟

PCR 序列特異性引物（sequence specific primer,SSP）分析法是使用能夠特異識別特定等位基因的引物通過PCR 擴增檢測序列多態性的方法，也稱作等位基因特異性引物PCR 法。本實驗是應用PCR-SSP 法檢測MN 基因型。

[實驗原理]

根據決定某等位基因的堿基性質，設計3′端*個堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR 反應過程中，只有引物3′端*個堿基與決定特定等位基因的堿基互補時才能實現DNA 片段的完全復制，根據PCR 產物的有無進行等位基因的分型。

[實驗器材]

PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽。

[實驗試劑]

引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Taq 聚合酶、丙烯酰胺、電極緩沖液、上樣緩沖液等

[實驗方法]

1.PCR擴增PCR反應體系為20μl（2個體系，分別為引物1和引物2），含模板2μl（約50ng），引物各1.5μl,dNTP1.6μl（0.4mM），10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應條件為94℃4min,94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30個循環。

2.PCR 擴增產物的檢測 取PCR 擴增產物2μl，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5 體積上樣緩沖液的酶切產物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。銀染顯色

[結果判定]

根據電泳譜帶的有無判定等位基因型別，僅有1 個體系檢測到譜帶者為相應特異性引物對應型（M 或N），2 個體系均檢測到譜帶者為MN 型。

[實驗討論]

1.注意事項 ①如引物結合序列存在堿基變異可能無擴增產物，導致錯誤判型；②在對照樣品分型準確的基礎上才能判定結果。

2.方法評價 該方法操作簡單，引物設計與實驗的復性條件要求較高。