PCR注意事項（二）

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？

A）涂布未轉化的感受態細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。

B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：

1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。

E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

　　　　　　 10×擴增緩沖液 　 10ul

　　　　　　 4種dNTP混合物 　 各200umol/L

　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　

　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　

　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　

　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L

　　　　　　 加雙或三蒸水至 　100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。