PCR基因擴增原理、材料和方法

一、原理
多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction , PCR）類似于DNA 的天然復制過程：經過變性、退火、延伸多次循環（圖1 ) , DNA 擴增倍數可達2 n 倍。即
Y = ( 1 + X ) n
式中，Y 為DNA 擴增倍數；X 為擴增效率；n 為循環次數
二、材料
（1）模板 DNA；PCR 引物；Taq DNA 聚合酶；dNTP ； PCR 緩沖液［20 mmol / L Tris -Hcl 緩沖液（pH 5.3 ) , 1.5 mmol / L MgCl2 , 25 mmol / L Kcl , 100 μg / mL 滅菌明膠或無核酸酶的牛血清白蛋白，0.05 % Tween 20 〕；石蠟油。
（2）乙肝病毒基因的PCR 檢測試劑盒

（3） PCR 擴增儀。

圖1 PCR 基本原理示意圖

三、方案
1 、經典的PCR 擴增方案
經典的PCR 擴增方案為：
反應總體積 100μL
模板DNA 105 -106 個分子
PCR 引物 20 pmol / L
Taq DNA 聚合酶2U
dNTP 50 μmol / L
PCR 緩沖液
20 mmol /L Tris-HCI 緩沖液（pH8.3 )
1.5 mmol /L MgC12
25 mmol /L KCl
100μL 滅菌明膠或無核酸酶的牛血清白蛋白
等體積石臘油覆蓋。
2、乙肝病毒基因的PCR 檢測
1 ） 標本處理
PCR 的主要因素
1、模板DNA
單鏈、雙鏈DNA 均可作為PCR 的模板。
DNA 樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。
模板用量依具體實驗而定，一般為100 μL 反應液有105 -10 6 個目標分子。
PCR 反應時模板變性要充分。
2、PCR 引物
PCR 引物設計是否成功是能否獲得高質量PCR 產物最關鍵的因素之一。在設計和應用時，需注意以下重要環節：
（1）一對PCR 引物相互之間的3 '末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。
（2）要避免引物分子內序列自互補
（3）引物的熔點溫度（Tm 值）。 Tm 值與引物的堿基組成和長度有關；PCR 引物的GC / AT 應與要擴增的模板DNA 相當或略高些。一般熔點溫度以大于55 ℃ 為宜。
（4）一般來說，PCR 產物≤500 bp 時，引物長度選擇16-18 bp；PCR 產物≥5kb 時，引物長度選擇24 bp 左右為宜。
（5）引物的3 '末端必須與模板嚴格互補，而5 '末端的要求可靈活些。
（6） 設計的引物應通過計算機軟件對引物二聚體形成、自身互補性及特異性進行分析。
（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5 '端加上限制性內切核酸酶位點。為了保證內切酶有效酶切擴增產物，一般在酶切位點的5 '端再加上幾個額外的堿基。
3、熱穩定DNA 聚合酶（如Taq DNA 聚合酶）
一般用量為2.5U / 100 μL。酶量過多易導致非特異性產物的產生。
該類酶的最適溫度為75 ℃ ，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物一模板的非特異延伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應注意防止非特異性產物的出現。
4 、dNTP
PCR 常用的dNTP 濃度在50-200 μmol / L 。可根據具體實驗來確定最適的dNTP 濃度。
5 、PCR 緩沖液
因PCR 反應中的dNTP 能與Mg2+結合，影響反應液中游離Mg2+濃度，所以應按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的PCR 反應中（dNTP 濃度200μmol / L ) , Mg Mg2+濃度約為1 .5mmol / L。
6 、PCR 循環的溫度
預變性：起始變性的時間應該長些，以使變性充分。一般為94 ℃ 3 -5 min 。變性不完全時，DNA 雙鏈會很快復性，影響PCR 反應，但若變性溫度太高（不宜超過95 ℃ ），會影響Taq 酶活性。
變性：一般為94 ℃ 30s 或95 ℃ 20s 。
引物退火：應根據具體反應中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定，一般為50-72 ℃ 。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物3 '端不正確核苷酸的錯誤延伸。
延伸：一般為72 ℃ 60 -90s 。最后一個循環后應在72 ℃ 保留5 min ，以保證PCR 產物合成的完整性。
7 、平臺效應和PCR 循環的次數
在PCR 的后期，由于產物的堆積，將使原來產物以指數增加的速度變為平坦曲線，即所謂平臺效應。它的出現是由于PCR 原料的不斷消耗、酶的穩定性的降低、終產物的阻滯效應及非特異性產物等多種因素造成的。所應選擇合理的循環次數，既能得到足夠量的PCR 產物，又不要無意義地增加循環次數。
8、操作環境
避免環境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA 的污染等