A)涂布未轉化的感受態細胞。
如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質粒,或產生氨芐抗型的菌落。
B)轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率。
例如,將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養過夜,產生1000個菌落。轉化率為: 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA。轉化率為:
1000克隆X10(3次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10(8次方)cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落,感受態細胞的轉化率太低。
C)如用pGEM-T正對照,或PCR產物,產生>20-40藍斑(用指定步驟10(8次方)cfu/ ug感受態細胞),表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質量標準好無核酸酶污染,不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應為白斑,如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落,連接有問題。