NatMethods:2014年值得關注的技術

　　單細胞測序被評為2013年年度技術

　　2014 年首刊，《Nature Methods》雜志將2013年度技術(Method of the Year 2013)授予了單細胞測序(single-cell sequencing)。同時，雜志還介紹了2014年值得關注的技術，包括CRISPR和基因組編輯、原位測序、迷你胞內探針、單粒子低溫電子顯微鏡等。

　　單細胞測序

　　近幾年來，基于單細胞測序技術的科學研究取得了突飛猛進的發展，其成果有望為一些重要的醫學問題提供新的解決方案。文章總結了2013年單細胞測序技術對于人類早期發育、癌癥以及神經科學研究等幾個重點領域的最新應用成果。文章特別指出，來自中國北京大學的一些研究團隊在這方面完成了許多優秀的工作，做出了突出的貢獻。

　　單細胞基因組擴增新技術(MALBAC)最早由哈佛大學謝曉亮教授發明，相關論文2012年發表于《科學》 (Science)雜志。該方法通過形成閉合環來抑制DNA片段被重復地復制，以保持DNA擴增的均勻性，解決了傳統方法對單細胞基因組擴增的強烈偏好性的問題。這項突破在單個細胞水平實現了全基因組93%的高覆蓋率，同時也能準確檢測單個腫瘤細胞中的染色體拷貝數異常。

　　2013年是單細胞基因組學突飛猛進的一年。由謝曉亮教授創建的北京大學生物動態光學成像中心(BIOPIC)在這一領域做出了重要貢獻。2013年謝曉亮教授哈佛大學課題組與北京大學BIOPIC李瑞強研究員小組合作，將MALBAC技術應用于人類單個精子基因組的測序研究中。他們對一個亞洲男性的99個精子進行了單細胞全基因組DNA擴增，并且利用高通量測序技術對每個精子分別進行了一倍深度的測序。這項工作首次實現了高覆蓋度的單個精子的全基因組測序，構建了高精度的男性個人遺傳圖譜，相關論文發表在《科學》雜志上。

　　美國科學院院士、斯坦福大學教授Stephen Quake評價說：“從PCR技術被發明的那天起，人們就在嘗試將其應用于分析單個細胞的基因組和轉錄組，但是直到今天單細胞測序才開始迅速發展。”

　　單細胞檢測技術在癌癥研究中也開始發揮重要的作用。2013年12月， BIOPIC白凡研究員和謝曉亮教授團隊與北京大學腫瘤醫院的王潔教授團隊合作共同在《美國科學院院刊》(PNAS)上發表文章，對于癌癥病人單個外周血循環腫瘤細胞(CTC)的全基因組、外顯子組進行了高通量測序，發現在某一類肺癌患者的所有循環腫瘤細胞中存在著一種特定的基因拷貝數變異(CNV)模式，而不同癌種CTC細胞的基因組拷貝數變異模式不同，為癌癥的早期診斷提供了全新的契機。這也是國際上首次實現對外周血循環腫瘤細胞基因組的高通量測序，標志著利用循環腫瘤細胞基因組測序信息進行腫瘤無創診斷時代的到來。

　　由于人類早期胚胎中的細胞數目非常稀少而且很難獲得，所以單細胞測序技術無疑對早期胚胎發育研究有著無可替代的重要意義。2013年12月，謝曉亮教授BIOPIC小組和湯富酬研究員小組以及北醫三院的喬杰教授小組共同在《細胞》(Cell)上發表文章，對人類單個卵細胞進行了高精度全基因組測序研究。該研究首次詳細描繪了人類單個卵子的基因組，建立了人類女性的個人遺傳圖譜。這一工作可以有效地幫助接受輔助生殖的女性同時檢測并排除染色體數目異常的胚胎以及攜帶單基因突變的胚胎，從而在大幅度提高輔助生殖成功率的同時、降低嚴重先天性遺傳缺陷嬰兒的出生率，提高人口素質。目前，該研究團隊正在嘗試將這項技術應用于胚胎植入前遺傳學診斷的臨床試驗中，獲益于這一技術的第一個嬰兒將在2014年出生，為這一技術途徑的廣泛應用帶來了希望。

　　2013年，湯富酬研究組、李瑞強研究組與北醫三院的喬杰教授合作，利用單細胞轉錄組測序技術，分析了不同時期的人類早期胚胎細胞的基因表達情況，這一研究發現了兩千多個全新的可能參與早期胚胎基因表達調控的長非編碼 RNA。該項工作發表在《自然—結構與分子生物學》雜志上。基因的表達模式與DNA 的表觀修飾有著密切的關系，因此，單細胞的DNA甲基化組分析可以用于研究癌癥細胞的特異性機理，但是此前的標準方法只能做到同時分析50-100個細胞。而同樣也在2013年，湯富酬課題組首次成功實現了單個細胞DNA甲基化組的測序分析。

　　表觀遺傳學專家Wolf Reik對單細胞測序分析的意義做出了充分肯定，他在2013年單細胞大會上說：“我之前還不是單細胞團隊中的一員，但是我很高興看到各個領域被單細胞技術推動的如此之快，有了新的技術，我們將會解決更加激動人心的生物學問題”。

　　文章指出，單細胞測序技術仍然在快速發展過程中，相信不久的將來將出現新一代更好的技術。科學家們期待在新技術的推動下，癌癥、生殖發育、神經科學、免疫等領域能夠有所突破。

　　CRISPR和基因組編輯

　　早在兩年前，《Nature Methods》就將年度技術頒給了基因組編輯技術，理由是這種技術能通過在某些物種基因組中進行靶向特異性的突變，從而解答并提出更多精確的生物學問題。CRISPR(規律成簇的間隔短回文重復)無疑是這一領域的新生力量，也再次掀起了基因組編輯的熱潮。

　　向導RNA/Cas9核酸酶復合物克服了以往工具的某些限制。向導RNA很容易設計，讓Cas9蛋白靶定基因組中幾乎任何想要的區域。Cas9作為核酸酶或切口酶，在DNA上誘導斷裂，隨后用于基因敲除、標簽插入或基因替換。事實上，Cas9的潛力遠遠不止DNA切割。

　　在《Nature Methods》10月刊上，哈佛大學的研究人員發表文章稱，作為一種RNA導向的dsDNA結合蛋白，Cas9效應物核酸酶是目前已知的第一個統一因子(unifying factor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。1 在他們看來，這種工具有望擴展，在復雜的表觀基因組上引入定制變化。

　　兩個研究小組最近也利用更為成熟的TALE來修飾表觀基因組。霍華德? 休斯醫學研究所的Bradley Bernstein及其同事就利用去甲基化酶/去乙酰化酶復合物來靶定增強子中的組蛋白標記，以探索它們在轉錄中的作用。2 而麻省理工學院的Feng Zhang博士則將TALE與光誘導系統相融合，來靶定組蛋白修飾酶，以改變表觀遺傳修飾。3

　　盡管這些方法很有前途，但TALE的定位比CRISPR/Cas9系統更為繁瑣。將Cas9與任何選定的酶相融合，我們不僅可改變組蛋白修飾，從而改變染色質狀態，還能影響DNA甲基化，實現全新的細胞功能調控。

　　然而，CRISPR/Cas9系統的特異性仍存在問題。向導RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的大部分序列更短，這意味著脫靶效應的幾率更高。近期發表的一些文章也證明了脫靶效應是真實存在的。

　　《Nature Methods》編輯Nicole Rusk認為，CRISPR是否能被精心打造成編輯表觀基因組的手術刀，而不必擔心脫靶效應，這在不久的將來就會清楚。

　　原位測序

　　新一代測序技術在RNA測序上的應用已帶來RNA內容的更全面了解。然而，現有的RNA測序技術是基于純化好的核酸，卻丟失了序列的空間背景。原位測序(In situ sequencing)有望更深入地了解細胞的基因表達程序及形態與局部環境之間的關系。《Nature Methods》編輯Tal Nawy認為，盡管預測這一技術的最終形式和潛力還為時過早，但目前已開始朝這一方向努力。

　　原位雜交等方法一直用于定位完整細胞和組織中的序列，但其限制在于必須清楚目標序列。在測序方面，許多技術都利用基于光的讀取，這表明它們可能與完整組織的成像相兼容。但擴增和測序反應需要特殊的底物，或需要在乳液中彼此分離。

　　去年10月，瑞典斯德哥爾摩大學的研究人員在《Nature Methods》上發表了一種新策略：滾環擴增(rolling circle amplification)。這種方法依賴一種鎖式(padlock)探針，它與目標序列的任一側雜交，以形成環狀模板，進行復制。由于產物是拴在模板上的，這提供了可靠定位，并可通過連續的寡核苷酸探針摻入，實現原位測序。

　　這是第一次實現了在細胞或者組織中對目的RNA分子進行測序，極大地保留了RNA分子的位置信息。也就是說，得到序列的同時，我們還能夠知道這些序列來自哪些細胞或者組織的哪個部位。

　　目前，這種技術仍處于原理驗證的階段。雖然測序長度只有4個堿基，但已經可用來檢測基因組中一些存在突變的短序列。研究人員以HER2轉錄本陽性的人乳腺癌組織為樣本，證明了轉錄本片段的測序可在組織切片中直接開展。

　　今后，有必要增加單細胞中可被拷問的轉錄本數量和序列長度，以及平衡圖像分辨率和組織范圍的成像能力。在這一放大過程中，圖像配準方法是關鍵要素，而定量與形態關聯的工具也是必要的。

　　這一技術的最終目標是測序多個位點，甚至是轉錄組或基因組中大的片段，但這仍需要解決信號密度的問題：在如此狹小的空間內，細胞包含了太多可被成像的信息。未來，我們有望看到測序與生物學背景的更緊密連接。

　　迷你胞內探針

　　追蹤小的分子并干擾其活性對了解活細胞如何工作很有用。隨著顯微鏡分辨率的提高，更多細胞進入到我們的視線。在這一背景下，選擇合適的探針就更為關鍵。于是，《Nature Methods》將目光投向一些細胞內的迷你粘合劑(mini-binders)，認為它們值得關注。

　　對于細胞內蛋白的探針而言，什么最關鍵?首先，它們應當是目標特異的。其次，不干擾蛋白的功能、定位或表達。此外，它們還應該足夠小，這樣才能接近角落中的蛋白。研究人員認為，遺傳編碼的探針是首選，因為它們能輕松導入特定細胞或靶定細胞器。

　　針對這些要求，研究人員開始將注意力轉向胞內抗體和適體。胞內抗體(intrabody)是指在細胞內表達并作用于細胞內組分的抗體。它們可從一些天然產生極小抗體的動物(如駱駝或鯊魚)中獲得，也可經大的哺乳動物抗體改造而來。適體(aptamer)是指與特定的目標分子結合的寡聚核酸或是肽鏈。適體常常從大量的隨機序列被挑選出來，但天然的適體依舊存在如核糖開關中。

　　編碼這些迷你粘合劑的基因可與其他遺傳編碼的元件或蛋白相融合，以監控或擾亂細胞內的組分和過程。美國南加州大學的研究人員就在《Neuron》報道了這樣的成果。他們將胞內抗體與神經突觸蛋白相結合，實時觀察活神經元的突觸。這使得研究人員首次觀察到興奮性和抑制性的突觸。

　　瑞士巴塞爾大學的研究人員也開發出一種遺傳編碼的方法，來快速去除真核生物遺傳體系中的綠色熒光蛋白(GFP)。這種基于納米抗體的方法是通用的，因為它依賴進化上高度保守的真核功能-泛素通路。納米抗體也被加州大學的研究人員所采用，來分析G蛋白偶聯受體(GPCR)的動態構象變化。

　　此外，哈佛大學醫學院的研究人員還以GFP為支架，將不同的分子組件組合在一起，驅動基因表達。他們以結合GFP的納米抗體為基礎，構建出一系列嵌合蛋白或融合蛋白結構域。當兩種這樣的融合蛋白被導入到細胞時，GFP將它們結合在一起，從而觸發這些融合蛋白的相互依賴的活性。

　　《Nature Methods》編輯Erika Pastrana認為，這些探針的進一步優化將使其應用更方便、更廣泛。鑒于它們的獨特性質，這些迷你粘合劑無疑是生物學實驗中大有前途的工具。

　　低溫電子顯微鏡

　　低溫電子顯微鏡(cryo-EM)雖然是結構生物學研究中的重要工具，但其潛力還未充分發揮出來。近期的技術進步大大提高了cryo-EM的分辨率，正在重振這一領域。

　　在單粒子cryo-EM實驗中，大分子集合體被冷凍在一層薄薄的冰中，并用電子顯微鏡成像。單個集合體的數千至數百萬幅圖像必須經過計算機比對和合并，以獲得一個三維結構。

　　與X射線晶體衍射相比，cryo-EM的一個明顯優勢就是不需要結晶，這大大拓寬了其研究領域，使生物大分子及其復合物的構象研究成為可能。運用這種方法，一些生物樣品如病毒和大腸桿菌70S核糖體的三維重構圖已經得到，但分辨率不是很高。

　　盡管人們早已認識到，cryo-EM有潛力達到原子級別的分辨率，但目前仍存在一些技術限制。它們包括難以產生足夠量的樣品，結構異質性，輻射損傷，電子束誘導的樣品移動以及相機效率低。

　　不久之前，cryo-EM的用戶只有兩種選擇來捕獲電子顯微鏡的圖像：低效的數字CCD照相機或不方便的照相膠卷。而直接檢測電子的新型照相機實現了更快速、更高效的圖像采集，解決了上述的一些限制。這些照相機記錄了樣品暴露于電子束過程中的一段視頻，可通過幀同步進行校正。

　　2013年發表的兩篇文章使用了這一策略。美國加州大學舊金山分校的研究人員利用一種新開發的單電子計數探測器，證實了電子束誘導的移動會大幅降低分辨率，并且，他們發現，快速讀取與幾乎無噪音的電子計數的組合使圖像模糊得以校正，將圖像信息恢復到高分辨率。這種方法大大提高了cryo-EM的圖像質量和數據采集效率，實現了接近原子的分辨率。

　　英國醫學研究委員會的研究人員也評估了新一代的直接電子探測器在cryo-EM結構測定上的潛力。利用一種新開發的statistical movie processing方法來補償電子束誘導的移動，他們發現核糖體結構可達到接近原子的分辨率，而粒子比之前少了兩個數量級。

　　結合快速改進的樣品制備方法、繁重任務的自動化以及數據分析的新算法，單粒子低溫電子顯微鏡有望為大分子集合體帶來新的見解，而這正是結構鑒定上極具挑戰性的一面。