NK細胞培養存在的問題與解決方法

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、 抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。

目前，NK細胞培養存在兩種培養方式：

1、滋養層細胞（人腫瘤細胞，即人白血病K562細胞）培養方式。

首先獲得具有不分裂不增殖但仍保持代謝活性的滋養層細胞。該細胞通過基因工程技術進行改造，再經過鈷60輻照，細胞膜表面穩定表達多種細胞因子，在多種細胞因子協同作用下，外周血單個核細胞中的自然殺傷細胞得到定向激活和擴增。

該種培養方式的價格相對便宜，僅有3000元左右。從培養結果來看，細胞收獲量可達到20億/L的水平，NK表型陽性率達到80%-90%左右。

2、純因子細胞培養方式。

顧名思義就是使用相應的細胞因子來刺激單個核細胞，向NK細胞方向誘導，并配合相應的細胞培養基，使NK細胞大量增殖。純因子細胞培養技術以其安全性高而著稱，其原因在于所使用的細胞因子，都是體內環境原本就存在的。培養過程相當于模擬體內環境，促進NK細胞的激活及大量增殖。

從培養結果來看，細胞收獲量可達到15-25億/L的水平，NK表型CD3-CD56+達到40%-90%左右。日本在該項技術上走在國際前列。由于日本老齡化嚴重，因此抗衰老研究較多。NK細胞在抗衰老研究中的應用符合其嚴格的風險管理原則。因此國內使用的純因子試劑盒多進口自日本。但由于技術壁壘，純因子試劑盒的價格一直居高不下，多在6000元以上。

但從培養結果來看，滋養層細胞培養方式性價比更高，但由于在培養過程中選用的滋養層細胞為腫瘤細胞，用戶對此種培養方式實際是心存排斥的。盡管從理論上講，經過相應處理的腫瘤細胞已經不再具備增殖的可能性，但其潛在風險難以證明可以完全排除。另外，就是倫理方面的問題，將正常細胞與腫瘤細胞共培養，然后將培養后的NK細胞回輸體內，確實存在難以克服的倫理障礙。正如上述原因，確實制約了滋養層培養技術的推廣。

2016年，某國產品牌在生物谷細胞治療會議中推出國內首款NK純因子培養產品，兩年間，300多家用戶對該產品的評價差異極大：大部分覺得很好，可以得到滿意的結果；一部分覺得不太好，因為不是所有樣本的培養結果都讓人滿意，總是有某些樣本的細胞數量少或者NK表型低。

經與用戶深入溝通，友康生物發現結果不理想的主要原因是某些樣本在培養的前半程（7天之前）密度上升緩慢，用戶難以貫徹廠家的補液原則。培養液不是補多了就是補得少，那結果會怎樣呢？

1、培養液補得多。培養液補多了，則NK細胞的密度更低，細胞生長更加緩慢，導致在2天后新的補液時點到來時，密度更加達不到補液要求。

2、培養液補得少。補液補少了，NK細胞生長過程中的代謝產物無法充分稀釋，整個培養環境變得有毒害，導致NK細胞密度更加難以上升。這類樣本，有的用戶2L培養體系僅能收到10億-20億的細胞數量。僅為正常值的15%-30%，給用戶造成了極大的困擾。

這種現象，在廠家看來是有些客戶尚未能完全掌握NK細胞的培養技巧導致。但站在用戶的角度來說，如果廠家在產品設計環節能夠做到不需要用戶面對NK細胞前期生長緩慢的情況，是不是就可以大幅減少甚至完全避免用戶的操作錯誤呢？是不是就可以大幅提升用戶自己的培養結果嗎？

結果是肯定的。于是友康生物根據客戶的反饋，重新設計了NK前期培養中的激活、擴增等環節的技術處理，推出2018版NK純因子培養產品。即便是狀態比較差的樣本，也可以在培養前期（7天之前）達到一個較高的生長密度，跳過了需要極其豐富經驗才可正確應對的在細胞密度過低時的補液要求。

此次產品升級的不是該產品的理論性能，即廠家的技術人員或經驗豐富的客戶技術人員可以達到的培養結果；而是該產品的實際性能——客戶的經驗不太豐富的技術人員可以達到的培養結果。客戶的技術人員僅僅需要按照廠家給出的補液原則常規補液即可，不會再遇到前7天細胞生長密度達不到理論密度的情況。極大降低了NK培養難度，大幅提升了該產品在客戶處的培養結果：50ml外周血或50ml臍帶血，均可達到40-60億/2L的細胞總數，60-90%的CD3-CD56+陽性率的培養結果。

外周血NK細胞倍增曲線：

細胞總數44.2億/2L 體系；CD3-CD56+：72.0%

臍帶血NK細胞倍增曲線：

細胞總數40.8億/2L 體系；CD3-CD56+：63.1%


另外，針對客戶提出的培養瓶與培養袋的組合困惑問題，友康生物在機理方面進一步明晰了NK細胞培養全程中培養瓶與培養袋之間接力培養的工藝細節與陷阱，給出了明確無誤、結果可信的操作指導，將指導用戶避開培養失敗陷阱，可大幅提供用戶的培養成功率，為用戶的業務拓展奠定堅實的產品基礎。