| 實驗材料 | |
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| 試劑、試劑盒 | 1％乙酸溶液（含麗春紅 S 染料）1％ 乙酸0.2 mol／L NaOH0.1 mol／L 乙酸溶液(含PVP-40)消化緩沖液1 mg／ml 胰蛋白酶層析溶液 A層析溶液 B |
| 儀器、耗材 | 0.22 μm 硝酸纖維素膜酸洗過的玻璃／Petri 培養皿細頭鑷子超聲波發生器離心過濾裝置反相 HPLC 柱子紫外監測儀圖形記錄儀層析柱爐（選用）自動蛋白質測序儀 |
| 實驗步驟 | 實驗試劑及儀器具體要求見其他。 1. 如免疫印跡和免疫檢測實驗所述，電泳分離目標蛋白并轉移到硝酸纖維素膜。最好使盡可能多的蛋白質結合到硝酸纖維素膜盡可能最小的區域，這點很重要。 2. 將硝酸纖維素膜放入盛有含 0.1％ 麗春紅 S 染料的 1％ 乙酸水溶液（如 50 ml 用于 8 cm × 10 cm 微型膠）的經酸洗的 Petri 玻璃培養皿。輕輕搖動 1 min。 3. 將膜移入 1％ 乙酸 1 min, 如有需要，換液至條帶顯跡清晰。 4. 戴無粉塵手套用刀片將目標蛋白條帶切下，放入微量離心管中，取一片空白膜作對照。本步驟得到的條帶也可放入含 0.5 ml 水的微量離心管中，于 -20℃ 保存。 5. 將膜放入 1 ml 0.2 mmol/L NaOH 中，振蕩 1 min 脫色，吸去 NaOH。立即加入 1 ml 含 0.5％ PVP-40 的 0.1 mol/L 乙酸中，室溫下輕輕搖動管子 30 min。 6. 用 1 ml 水洗膜 5 次。小心除去所有液滴（如管帽下的液滴）。 7. 用清潔的細頭鑷子將膜片轉移到干凈的玻璃表面（如經酸洗的玻璃平板或 Petri 培養皿），切成 1~2 mm 的小片，用鑷子收集膜片，擠去過量的液體。 8. 立即將膜的碎片移入盛有 25 ml 消化緩沖液的 0.5 ml 微量離心管中，加入 1 ml 1 mg/ml 的胰蛋白酶，混勻使膜均勻地泡于溶液中，室溫放置過夜。 9. 室溫高速微量離心 1 s, 回收粘在管壁和蓋子上的液滴。室溫超聲處理樣品 5 min。 10. 室溫用最大速度微量離心 1 min, 將上清移入離心過濾裝置，用 100 μl 消化緩沖液洗膜碎片，合并于上清，在最大速度微量離心樣品 20~30 s。如果不進一步分級分離，可凍結保存樣品。 11. 用 95％ 層析 A 液/ 5％ B 液，以 0.15 ml/min 的流速平衡 2.1 mm × 250 mm 的反相HPLC 柱，如有層析爐，可在 60℃ 進行分離以優化分辨效果。 12. 注射樣品，用 95％ A 液/ 5％ B 液洗柱子 10~15 min。用如下的梯度洗脫多肽：5％~40％ B 液 1 h 以上，40％~75％ B 液 30 min 以上，75％~100％ B 液 15 min以上。在 215 nm 監測多肽的洗脫。 13. 用圖形記錄儀根據全量程的波形調整至 0.05~0.1 AUFS 監測多肽洗脫峰的出現。盡可能縮小柱子到收集器之間毛細管的長度和容積，聚乙烯酮（PEEK） 管子（內徑 0.005 in）有助于達到此目的。 14. 當圖形記錄儀開始擺動說明有洗脫峰出現時，對一干凈的表面（如 Kimwipe 或前面的收集管）擦毛細管的尖，用微量離心管收集這部分組分，馬上蓋上蓋子置于干冰。 15. 比較樣品和空白硝酸纖維素膜的色譜圖，鑒定源于目的蛋白的多肽相應的峰。加樣于按 Applied Biosystems 所述方法經 Polybrene 預處理的玻璃纖維濾膜支持體中，進行測序。 |
| 注意事項 | 1. 精心細致的操作是不至于往樣品中偶然性引入污染蛋白質的關鍵。潔凈的工作環境、細心清潔的玻璃用具和儀器以及戴無粉塵手套是最起碼的預防措施。 2. TFA 的濃度應調整至相等于洗脫劑的紫外吸收（215 nm）。除 TFA 外，磷酸、鹽酸也可適用。 避免使用含氨或紫外污染物的緩沖液。 3. 胰蛋白酶在 60% B 液時被洗脫，并可用作內標。從特征上看，它的洗脫峰型比大多數多肽要寬。 4. 步驟 9 中盡可能縮小柱子到收集器之間毛細管的長度和容積，聚乙烯酮（PEEK）管子（內徑 0.005 in）有助于達到此目的。 5. 步驟 14 須戴干凈的手套，如果一直儲存于原始的容器并操作時都戴手套的話，商品化的微量離心管已足夠干凈。 6. 快速凍結能防止分離肽對離心管壁的吸收。樣品可以永久保存于 -80°C。 |
| 其他 | 試劑： 含 0.1％ （m/V) 麗春紅 S 染料（Sigma) 的 1％（V/V) 乙酸溶液 1％（V/V) 乙酸 0.2 mol/L NaOH 含 0.5％ （m/V) 聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40；Sigma) 的 0.1 mol/L 乙酸溶液 消化緩沖液 1 mg/ml 測序級的胰蛋白酶（Promega） 層析溶液 A : 含 5％（V / V) 乙腈的 0.1％ 三氟乙酸溶液 層析溶液 B : 含 70％（V / V) 乙腈的 0.085％ 三氟乙酸溶液 0.22 μm 硝酸纖維素膜（如 Schleicher&Schuell） 儀器： 酸洗過的玻璃或 Petri 培養皿 細頭鑷子 超聲波發生器（如 Bransonic 12） 離心過濾裝置，0.22 μm 濾膜，低蛋白質結合 反相 HPLC 柱子（如 Vydac）、紫外監測儀、圖形記錄儀 層析柱爐（選用） 自動蛋白質測序儀（Applied Biosystems） |