MIDASTM確證Biomarker（一）

生物標志物的發現是一個復雜而漫長的過程，AB公司結合QTRAP系列質譜系統的獨特功能與掃描模式，創造性地開發出MIDASTM（MRM Initiated Detection And Sequencing）工作流程，滿足了生物標志物驗證與確認的4S要點，可以準確、快速、簡便地完成大樣本量的生物標志物驗證與確認工作。本文結合實際的應用案例介紹了這一技術。

生物標志物（Biomarker）的發現是一個復雜而漫長的過程。在此研究過程中可能會面臨各種困難與挑戰。其一，蛋白質類生物標志物在體內變化不大，難于檢測。通常不是有和無的變化，而僅是體內濃度發生相應改變，這種變化量基本上都小于10倍，通常在5倍變化量之內；其二，個體之間，甚至于同一個體的不同批次樣本之間，存在本底差異，難于區分。實驗證明，臨床樣本之間的差別大于動物樣本，而動物樣本差異大于細胞培養樣本；其三，最有效的標志物通常濃度很低，而樣本量也有限，所以要求分析手段必須具備極高的靈敏度；最后，生物體內變化極其復雜，即使獲得有很好靈敏度與特異性的單個標志物，要想通過設定此單個標志物的精確閾值來標定某一生理狀態仍然非常困難。所以，通常生物體某一生理狀態就需要由多個標志物共同來標定，而非單一標志物就可以完成。

一般來說，生物標志物的發現包括發現或鑒定（Discovery），驗證（Verification），確認（Validation）三個步驟，而后再進入臨床檢驗等更深入的階段。鑒定步驟可以通過生物質譜儀與蛋白質差異表達定量等相關技術完成。但由于生物標志物必須具備廣泛的代表性與標志性，所以驗證與確認步驟的樣本量通常是鑒定階段的數十至數百倍，因此，驗證與確認生物標志物的技術方法需滿足4個要點（即4S要點）：速度快（Speed），特異性高（Specification），靈敏度高（Sensitivity）和具有統計學意義（Statistics）。而目前常規的Western Blot或ELISA方法，由于成本高、速度慢，特異性抗體制備難度大等諸多技術難題，很難在進行大批量樣本驗證與確認的階段中發揮主要作用。因而就迫切需要有新的技術完成此項重任。

由于充分地認識到生物體標志物驗證與確認工作的重要性、復雜性和廣大研究人員的迫切需求，AB公司在此領域投入巨大資源，結合QTRAP系列質譜系統的獨特功能與掃描模式，創造性地開發出MIDASTM（MRM Initiated Detection And Sequencing）工作流程，滿足了4S要點的技術要求，可以準確、快速、簡便地完成大樣本量的生物標志物驗證與確認工作。QTRAP是具有革新性設計的液相色譜-串聯質譜儀，是一臺集優異的定性功能與定量功能于一體的質譜儀，它把四極桿-線性離子阱質譜技術首次結合在一起（如圖1所示），既保留了串聯四極桿質譜儀（空間串聯質譜）的優點，如：母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能；以及線性離子阱（時間串聯質譜）的所有優點，如子離子掃描靈敏度高，MSn，高分辨掃描等等，又克服了傳統3D離子阱質譜儀的缺點，如低質量截止點（1/3效應）、“空間電荷效應”、碰撞效率低、定量差等。更重要的是，同時還開發出了空間串聯+時間串聯的聯動新技術，如MRM-EPI，MRM-MS3，MRM-NL等等。MIDASTM工作流程就是建立在這一高技術平臺之上的。

圖1.   QTRAP 儀器結構示意圖：具備完整的三重串聯四極桿質譜，又增加了線性離子阱的功能，還首次完成了這兩類質譜功能的集合和聯動。

通過用其它各類技術方法，包括蛋白質組學相關技術，基因組學相關技術，各類已發表文獻等，發現出具有潛在生物體標志物性質的蛋白質或基因，利用已知的該蛋白分子的基因序列或氨基酸序列，就可應用MIDASTM方法進行大批量樣本的蛋白分子驗證與確認工作。

其主要工作模式如下：將分子的基因或氨基酸序列輸入MIDASTM設計器軟件的序列框，設定相關參數后，軟件自動構建排列出MRM掃描模式所需要的母-子離子對（如圖2所示）。而后，3200 QTRAP或4000 QTRAP質譜儀通過MRM掃描模式對大批量的樣本監測，查看是否有此排列的母-子離子對出現。如若信號出現，證明此分子在樣本中存在，儀器將自動切換至MS/MS掃描模式，確定此母離子的碎片離子信息，并再次鑒定并確認該分子的結構。如若在MRM掃描工作中，未發現預期的母/子離子對，就說明該分子在此樣本中不存在。由于MRM掃描模式高效快速，且具有極高靈敏度，因此非常適合于高通量驗證與確認生物標志物。

圖2.  MIDASTM設計器軟件的序列框口，設定相關參數后，軟件自動構建排列出MRM掃描模式所需要的母-子離子對。

應用實例

這里給出一個應用案例，通過4000 QTRAP LC-MS/MS質譜系統提供一種全新的技術方案，去進一步確證質譜已經鑒定出的低豐度蛋白質的存在與否。所有預期的胰酶酶切蛋白質所產生的多肽通過MRM掃描模式監測，驗證其是否存在，一旦信號被檢測到，儀器會立刻自動切換到高靈敏度線性離子阱 - 增強子離子掃描方式（EPI）采集數據，從而確認蛋白質的真實存在性。這種MRM觸發的檢測與驗證方法最近也被用于蛋白質酶切后低豐度磷酸化肽的檢測[4,5]。

人體mRNA剪拼體（Spliceosome）的蛋白質組成和其主要成份——小核糖核蛋白顆粒（snRNP）U1, U2，[U4/U5/U6]（tri-snRNP）的復合物，如圖3所示。 在mRNA前體的體外剪切拼接過程中，幾種不同的復合物按一定次序組裝在mRNA前體上。除如圖3所示的snRNPs外，還有一些相關聯的暫時性結合的拼接因子，其中有些因子的數量很少，濃度極低。為了鑒定這些因子，這些復合物經甘油梯度離心后，使用LC-MS/MS進行分析鑒別。

圖3.  人體mRNA剪拼體的幾個功能性階段，在蛋白質剪切過程中，可以確定剪拼體（A、B、B*和C）在不同功能階段的體外生物化學物質，這些復雜的物質存在很大的差異，不僅是體現在主蛋白組分，而且還體現在暫時組裝的剪拼因子之中。