HPLC故障排除：保留時間問題（三）

圖9的示例顯示了在約25％、50％和75％B的線性（箭頭）條件下，空白梯度運行呈現有規律的偏移。

圖8. 圖9顯示了HPLC系統的梯度階梯測試結果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯級；（b）以1％的梯級向上跟蹤至45-55％。箭頭顯示了50和51％之間的“較短”梯級。來源[4]。

與這些條件相對應的階梯測試如圖8a所示，并且在這個度量（放大比例）下表現良好。

為了更仔細地檢查問題區域，在45-55％B范圍內以1％的增量進行階梯測試，如圖8b所示。

這個擴展（放大）圖清楚地顯示了在50％和51％之間的梯級中，存在不規則性。

在線性圖中的定期（有規律間隔的）誤差（圖9）表明，控制比例閥的算法或比例閥本身存在問題。

在目前的情況下，調整控制（控制軟件）軟件無法解決問題，因此應更換比例閥，以解決問題（因此更換了比例閥，問題被解決）。

圖9. 故障比例閥線性梯度圖。箭頭顯示線性偏離；繪制下面的虛線以供參考（虛線為標準參考線）。以1mL/min的速度運行梯度0-100％B 15分鐘；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；檢測UV 265nm。來源[4]。

盡管可以假設單一來源是導致特定HPLC問題的原因（雖然通常可以假定某HPLC問題只有一個故障原因），但情況并非總是如此。

圖10a顯示了以非常淺的梯度（30分鐘內19-24％ACN）連續三次注射肽樣品的結果（顯示了一種多肽樣品三次連續進樣，窄梯度洗脫（30分鐘內19-24%乙腈梯度洗脫））。

由于懷疑存在流量（流速）問題，因此在雙活塞雙泵系統中更換了所有8個止回閥（單向閥）和4個泵密封件（圈）。

這大大改善了保留變量（保留時間大為改善），保留范圍從2.1分鐘變化到1.0分鐘（圖10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。

為了進一步研究問題，將溶劑預混合到裝有15% ACN的A容器和裝有25％ACN的B容器中（在A瓶中預混合15% 乙腈，在B瓶中預混合25% 乙腈）。

當調整儀器設置以產生與圖10a和b相同的梯度時，獲得圖10c所示的結果。盡管儀器的配比精度在±0.1％的規格范圍內，但對于非常淺（窄）的梯度來說仍是不夠的。

預混合溶劑將有效精度從0.1％提高至0.01％，如果該樣品希望具有令人滿意的保留時間再現性，這點是必需的。
預混合可以提高系統性能，以滿足苛刻的分離要求。

圖10.三次連續注射肽樣品的擴充（放大）色譜圖。產生的色譜圖：（a）使用原始系統配置（b）更換所有止回閥（單向閥）和泵密封件（圈）后（c）使用預混流動相。色譜柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃運行，并在215nm檢測。梯度：30分鐘內19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。來源[5]。