DNA的PCR擴增及Southemblot分析

    DNA存在于細胞核和線粒體內．攜帶遺傳信息，決定著細胞和個體的遺傳性狀。細胞DNA的檢測有助于了解DNA的特征，如復制、表達以及變異情況等，從而在分子水平研究細胞的生物學特征，細胞的DNA檢測主要包括DNA的提取及檢測。檢測方法有多種，如PCR、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism；RFLP)、基因芯片、原位雜交等。

一、DNA的提取

(一)原理

    真核生物的一切有核細胞(包括培養細胞)都能用來制備基因組DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿／異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。

    蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中DNase的活性；而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸．使DNA分子完整地分離出來。

(二)材料

1．組織或培養細胞。

2．試劑

(1)細胞裂解緩沖液：Tris(pH8．O)10O mmol／L、EDTA(pH 8．0)500 mmol／L、NaCl 20 mmol／L、SDS 10％、胰RNA酶20μg／ml。

(2)蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶K溶于1ml滅菌的雙蒸水中，一20℃備用。

(3)TE緩沖液(pH 8．0)：高壓滅菌，室溫貯存。

(4)酚／氯仿／異戊醇(25：24：1)。

(5)異丙醇、冷無水乙醇、70％乙醇、滅菌水。

3．器具恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計、移液器、玻璃勻漿器、離心管(滅菌)、吸頭(滅菌)。

(三)方法

1．取培養細胞沉淀約107個置于1．5ml離心管中，加入蛋白酶K(500μg／ml)20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴，30min．也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000r／min離心5min，取上清液入另一離心管中。

2．加2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用lOOμl吸頭挑出，晾干，用200μl TE重新溶解(可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行)。

3．加等量的酚／氯仿／異戊醇振蕩混勻，離心12000r／min，5min。

4．取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿／異戊醇，振蕩混勻，離心12000r/min，5min。

5．取上層溶液至另一管，加入1／2體積的7．5mol／L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇．混勻后室溫沉淀2min，離心1200 r／min，10min。

6．小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7．用lml 70％乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 r／min 5min。

8．小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9．加200μl TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或一20℃保存備用。

10．吸取適量樣品于分光光度計上檢測濃度和純度。

(四)注意事項

1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不宜過長。

2．在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。

3．提取的DNA不易溶解：不純，含雜質較多；加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

4．電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

5．分光光度分析DNA的A280／A260小于1．8；不純，含有蛋白質等雜質。在這種情況下，應加入SDS至終濃度為0．5％，并重復步驟2～8。

6．酚／氯仿／異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。