DNA序列分析技術

PCR 產物

瓊脂糖TE水飽和酚無水乙醇70％乙醇TEMED測序酶溴化乙錠

電泳儀離心管離心機冰浴箱恒溫板DNA 測序儀

1 混合反應物

（1）取2.5μl 純化好的PCR 產物［相對于2.5μl 測序試劑盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，進行瓊脂糖凝膠電泳。

（2）凝膠用溴化乙錠染色，用流水沖洗脫色后，在紫外光下進行照相記錄。參照pGEM-3Zf

（十）DNA 估測待測DNA 模板的濃度，以確定測序反應中應取的模板量。

（3）在一個標記的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反應物：

DNA 模板 適量

引物（10pmol／ml） 0.5μl

加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）

100℃下變性2 分鐘，再冰浴2 分鐘后短暫離心，然后加：

DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中測序液 4.75μl

或 FS-DNA Sequencing Kit 中測序液 4.0μl

終體積 10μl

（4）用微量取樣器將反應物充分混合后，加 20μl 石蠟油覆蓋。

2 熱循環反應

該反應中降溫時間非常關鍵（約1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的熱循環儀（PCR 儀，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 熱循環儀。將反應管放入熱循環儀中，按以下程序進行熱循環反應：

（1）96℃ 1 秒鐘

96℃ 30 秒鐘

（2）50℃ 1 秒鐘

50℃ 1 分鐘

（3）60℃ l 秒鐘

60℃ 4 分鐘

共需25 個循環。

3 純化測序產物

純化測序產物最好的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作過程如下：

（1）輕彈柱，使Cephadex G-50 膠粉從柱底部揚起。

（2）移去柱上蓋，加入 800μl 去離子水，再蓋上蓋振蕩，以除去氣泡。

（3）在室溫下放置30 分鐘，以水化凝膠柱。

（4）移去柱上蓋和下蓋，將凝膠柱放入一個配置好的洗脫管中，讓多余液體流出。

（5）倒去液體，將柱連同洗脫管一起在 3 000r／min 下離心 2 分鐘。

（6）將柱放入一個1.5ml 離心管中，用微量取樣器將測序反應物取出，注在凝膠柱中央。注意避免帶入石蠟油。

（7）3 000r／min 下離心 2 分鐘。應注意柱的定向必須與第一次離心時一致。

（8）將樣品放在真空干燥離心機中干燥。

（9）將干燥后的樣品貯存于―70℃下待進行電泳。在此條件下保存1 年之久的樣品其熒光也不會猝滅。

應注意的是，Centri-sep 柱體可反復使用多次。每次使用過后，要用自來水洗3 次，蒸餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。

4 電泳

使用ABI 公司的377 型全自動DNA 序列分析儀電泳，并記錄序列數據。控制軟件為PRIM377 Collection。電泳過程如下。

（1）聚丙烯酚胺凝膠濃度為4.25％，配制過程如下：

尿素 18g

Amberlite 離子交換樹脂（Sigma，MB-lA） 約39g

40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml

去離子水 25ml

將混合液在電磁攪拌器上攪拌10 分鐘。

（2）取5ml 10 倍TBE，通過2μm 濾膜抽濾后，再抽濾以上膠液。

10 倍TBE 配方：

Tris-base 108g

硼酸 55g

Na2 EDTA（2H2O） 7.44g

定容至 1L

（3）將濾過液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％過硫酸胺（APS），輕搖混合后，用50ml 無針頭注射器將膠注入已裝配好的玻璃板中。

（4）1 小時后，將膠安裝于全自動序列儀上預電泳 30 分鐘，恒壓1kv，并使溫度升至 51℃。

（5）預電泳的同時，取出 36 份―70℃下貯存的樣品，各加入5μl 載樣液（50μl 試劑盒中配備的loading buffer＋250μl 去離子甲酰胺，臨用前配制）。

（6）將混合液在旋渦混合器上振蕩，94℃下變性2 分鐘，冰浴2 分鐘后短暫離心。

（7）各取 1.5μl 點樣，恒壓 1.68kv 電泳 7 小時。機器將自動分析和記錄序列結果。常有電泳道識別錯誤的情況，此時應人為修復。

Centri-sep 柱體可反復使用多次。每次使用過后，要用自來水洗3 次，蒸餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。

注意測序引物特異性。