DNA的定量實驗原理和步驟

一、 實驗原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環和嘧啶環的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。

1 OD260相當于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此來計算核酸樣品的濃度。

紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為2.0, 若DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。

對于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進行測定。DNA 本身并不產生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結合后，DNA樣品能在紫外光的激發下產生桔紅色熒光。熒光強度與被結合的EB的量成正比，而被結合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達1～5ng。由于是基于目測，所以是估計水平。 該方法經濟簡便，但準確性較低。

二、儀器及試劑

1. 儀器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設備。

2. 試劑及配制：

5× 上樣緩沖液：

配制10 ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 ml

10% SDS 50 ul

50% 甘油 2.5 ml

0.2% 溴酚藍 10 mg

0.2% 二甲苯青FF 10 mg

加去離子水至10 ml

其它試劑：0.1×TE 、DNA標準液，EB儲存液（10 mg/ml），

三、實驗步驟

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數稀釋。

（2）開機，儀器會自動對光路及分析軟件進行檢測，待顯示屏上出現“instrument Ready” 時，進入核酸測定窗口

（3）調零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內的樣品杯取出，換上待測樣品。

（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉入石英樣品杯，放入樣品槽，關閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進入分析狀態。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。

（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風干后，再加入下一個待測樣品。

（6）DNA純度：以OD260/ OD280比值來反映。當OD60 /OD80比值 <1.8時，說明樣品存在蛋白質或酚等雜質，可采用平衡酚/氯仿?D異戊醇再抽提除去蛋白質或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。

2. EB熒光分析法

（1）瓊脂糖凝膠的制備。

（2）樣品的準備。把待測DNA樣品進行1:2連續稀釋，并準備一份DNA標準液作對照。

（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。

（4）電泳。用100V穩壓電泳至溴酚藍指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。

（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴重污染干擾核酸紫外線吸收物質的情況。

四、常見問題

1． 紫外分光光度法不能區分DNA分子的構型，如質粒DNA分子的超螺旋、開環、線狀三種構型，也不能區分染色體DNA和RNA等。由于測定吸收光度A260時，難以排除RNA、染色體DNA、以及DNA解鏈的增色效應等因素的影響，因此測得的數據往往比實際濃度偏高。

2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，OD320也越高。

3．測樣品時使用的石英樣品杯比較貴，要小心不要摔破，持杯時也不要接觸透明的光面以避免干擾測定。