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器材準備
1. 在培養室實驗臺上放置下列物品：
解剖顯微鏡
表面和透射照明用的顯微鏡燈泡
裝有 70% 酒精的帶蓋不銹鋼深盤
Dumom 5 號鉗子，至少兩把
柳葉刀 4 把
精細彈簧剪一把
洗瓶，內裝 75% 酒精
紙巾
盛裝廢棄雞蛋的大燒杯
墊放培養皿的紙巾
100 mm X 20 mm 的培養皿
裝有 Polytowel 的加蓋不銹鋼盤
放大倍數 100 （物鏡X目鏡）的組合顯微鏡，計數細胞用
2. 在培養室超凈臺上放置下列物品：
本生燈
可傾斜擺放 15 ml 試管的試管架
盒子，內裝：離心管，加有棉花塞的巴斯德吸管，吸球
獨立包裝的移液管 1 ml、5 ml 和 10 ml
泵
血細胞計數板
Hank 氏平衡鹽溶液（HBSS）及無 Ca2+ 無 Mg2+ 的 HBSS
2.5% 胰酶溶液
2 個裝有一半體積 HBSS 的 35 mm 規格的培養皿
25 ml 規格的燒瓶
(1) 把幾張 lens 紙剪成 2 英寸X2.5 英寸的小長方形，以 Swinny 濾器支持板為模板把一疊濾紙剪成圓片，并在超凈臺中用乙醚洗滌，前后共 2 小時，換 2~3 次乙醚溶液。
(2) 用無水乙醇洗滌 2 小時，其間換液 2~3 次。
(3) 用蒸餾水洗膜 5~10 遍并浸入水中過夜。
(4) 取一蓋玻片，部分插入水中，用小鉗子把圓紙片拖上蓋玻片，然后紙片朝上放在超凈臺的紙巾上直至紙片干燥為止。
(5) 將上述小圓紙片連同蓋玻片一同放進密閉的培養皿中保存，或用小鉗子小心將小圓紙片揭下單獨保存。
(6) 裝 Swinney 濾器。按如下順序先裝下半部：墊圈，濾膜支持物，lens 紙片，O 型墊圈及濾器上半部，上下兩部分先松松地擰在一起。
(7) 在凸出的出料口處插入一支 18# 或更大規格的針頭。放進培養皿中，貼上高壓滅菌帶置 Fast-dry 中高壓滅菌。
(8) 使用：擰緊濾器，安上注射器推進桿。
3. 超凈臺中準備膠原包被的組織培養平皿
(1) 融化膠原溶液（Life Technologies）：4℃ 過夜或 37℃ 水浴 15 分鐘。
(2) 制作涂布器：煤氣火焰加熱融化巴斯德吸管頭部，在其后 1/2 英寸處加熱直至融化彎成直角，晾涼待用。
(3) 往培養板上滴數滴膠原液。35 mm 規格的平板需要 1~2 滴，100 mm 規格的平板需要 3~4 滴。
(4) 用涂布器把膠原涂布均勻，務必使邊緣也布滿。
收集和解剖胚胎
4. 用 70% 酒精擦拭實驗臺面，解剖鏡和燈放在一側。
5. 鋪紙巾，上放一排培養皿，一個用以盛放收集到的胚胎，其余的放置開過口的雞蛋。
6. 裝廢棄雞蛋的燒杯也就近擱置。
7. 小心地捏著無菌毛巾的折邊從盒中取出放在計數板上，折邊向遠離你的一邊。捏著毛巾的長邊邊緣小心打開。從酒精中拿出器械，注意尖頭向上，然后尖頭朝折邊放在毛巾上，再重新蓋好。
8. 用 70% 的酒精擦拭或噴淋 11 日齡的雞蛋，然后敲碎，放進培養皿中。用鉗子輕輕夾著胚胎頸部，垂直拎出放在另一個培養皿中。以同樣的方式收集所有的胚胎。若是死胎，全扔掉，包括培養皿。
9. 胚胎移至解剖鏡下，光強度至最小的表面光線，用鑷子把胸部皮膚剝離。
10.
用兩把鉗子固定住胚胎，從胸腔肋骨處剪開肌肉，先緊貼并沿著胸骨方向切一口，再一直切到翅膀連接處，肌肉一離開附著點立即收縮，緊貼并沿著胸腔肋骨切一小口一直拉至翅膀連接使肌肉完全脫離下來，放進裝有
HBSS 溶液的 35 mm 培養皿中，以同樣的方式分離另一半胸肌肉組織。
11. 所有肌肉收集完后，于解剖鏡下檢查。解剖鏡配上比第9步更大功率的透射光源。
12. 清理完全部肌肉后，把培養皿放在解剖鏡平臺上，操兩把解剖刀將肌肉組織切成 1 mm3 見方的塊。巴斯德吸管套上橡皮吸球吸些 HBSS 溶液入培養皿。
13. 挑起組織塊并轉移至一燒杯內，杯中裝有 10 ml 用 HBSS 溶液配制的 0.25% 胰酶。該酶無鈣和鎂離子。鋁箔包住燒杯口放進 37℃ 二氧化碳溫箱中孵育 20~30 分鐘。
胰酶消化細胞
14. 將上述肌肉組織轉移至一離心管中，在醫用離心機上中等轉速離心 2~3 分鐘使肌肉組織剛好能沉入管底，不要離心太久形成堅實的團塊。
15. 小心將胰酶倒入一無菌培養皿中。
16. 離心管中加入 2 ml 肌肉細胞用培養基（8:1:1）。
17. 先查看一下加棉塞的巴斯德吸管尖頭，保證光滑均勻無裂口，套上吸球吸些許培養基浸潤其內壁。然后插到離心管底，輕輕吹打。
18. 加入 3 ml 8:1:1 培養基，稍加吹打讓細胞分散均勻，然后通過了 lens 濾紙的 Swinney 濾器過濾至一新管中。
計數、接種細胞
19. 計數細胞。
20. 每只 35 mm 規格的培養皿細胞接種密度是 3X105 細胞/ml，共 1.5 ml。大量培養時，如用 100 mm 規格的培養皿，通常每只培養皿接種 10 ml 的 5X105 細胞/ml 的細胞。
21. 于 37℃，5% CO2 水套式溫箱中培養細胞。頭三天，每天更換培養基，以后，隔一天換一次。
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