飽和氯化鈉法提取外周血DNA

實驗概要

本實驗用飽和氯化鈉法從外周血中提取了基因組DNA 。

實驗原理

以蛋白酶K 和SDS 裂解細胞釋放DNA，而DNA 在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高，Na 與帶負電的DNA 結合成DNA 鈉鹽，這時DNA 在溶液中呈溶解狀態。以氯仿抽提DNA，去除溶液中蛋白雜質后以3M NaAc 沉淀DNA。

主要試劑

1. TE buffer（pH 8.0）
2. 蛋白酶K
3. SDS
4. 飽和氯化鈉
5. 氯仿
6. 3M NaAc（pH 5.2）
7. 異丙醇
8. 乙醇

主要設備

1. 電熱恒溫水槽
2. 高速離心機

實驗材料

抗凝外周全血

實驗步驟

1. 取0.5 ml 抗凝外周全血，加入0.8 ml 生理鹽水混勻后，室溫離心10000rpm 1min。
2. 棄上清，留0.1 ml 沉淀，加入0.4 ml TE，懸浮細胞后加入10 mg/ml 蛋白酶K 5 μl (終濃度100 μg/ml)，10% SDS 50 μl (終濃度1%)，并輕輕混勻。
3. 37℃水浴消化過夜。
4. 加入1/3 體積飽和氯化鈉，并充分混勻，靜置10 min 后以10000 rpm 離心10 min。
5. 取上清液于另一新管內（1.5 ml Eppendorf 管），加入等體積氯仿并充分混勻，離心同步驟4。
6. 小心吸取水相至另一新管內，加入1/10 體積的3 M NaAc（pH 5.2）混勻后，加入0.7 體積的異丙醇并輕輕混勻， 10000 rpm 離心5 min。
7. 棄上清，加入70%乙醇0.5 ml，可見乳白色絮狀DNA 團塊，充分洗滌DNA沉淀，離心步驟同6。
8. 盡可能棄凈上清液，空氣中干燥或置37℃溫箱，干燥DNA 5 min。
9. 加入TE（pH 8.0）20～50 μl 溶解DNA，4℃存放待用。

注意事項

步驟6 中，在將上清轉移到一個新管過程中，注意只吸取水相液體，該步驟是獲得高純度DNA 的關鍵。