限制性內切酶（restrictionenzyme）酶譜分析

一、實驗目的

在DNA上以限制性內切酶的酶切位點作為標記所繪制的物理圖譜就是限制性內切酶圖譜，限制性內切酶圖譜與其他相關資料聯合使用，可用于基因克隆、分離和基因功能研究。

二、實驗原理

（一）酶切圖譜的構建

限制性內切酶在DNA上有特異的識別和切割位點，可將DNA切開而得到兩個或兩個以上的大小不同的片段，這些片段可通過電泳分離并檢測其大小。雙酶切法酶切圖譜構建是使用兩種不同的限制性內切酶對同一個DNA分子進行單酶切和雙酶切，將所得的片段進行對比組裝，對交替區域進行加減以確定酶切位點的相對位置。

假如n代表某限制性內切酶在DNA上的酶切位點數，F代表完全酶切后的片段數，則線形DNA單酶切后:F=n+1,而環狀DNA單酶切的F=n。若使用雙酶切時，所得的片段中有兩類：一是與單酶切片段完全相同的保留片段：二是單酶切片段備再切割后小片段，這些的片段的分子量之和等于單酶切片段的分子量。將以上片段電泳后，遵循以下“三三”規則進行分析：

1、區分三類片段，并做好標記：

（1）消失片段Fd(Disppeared fragment)，即單酶切片段經雙酶切后消失的片段。

（2）保留片段Fr(Remaiined fragment)，即單酶切片段經雙酶切后仍保留的片段。

（3）接頭片段Fl(Linker fragment)：即雙酶切后出現的新片段，由Fd再切割而來。

2、分析三類片段的關系：

（1）兩種酶的Fd總數相同，而Fr總數不等。

（2）Fd的片段總數為的1/2。

（3）兩種酶Fl的相同。

3、排列三類片段，構建酶切圖譜：

（1）首尾排列：每種酶Fd的片段的首尾只能接Fl片段。

（2）夾心排列：一種酶的Fr片段只夾于另一種酶的兩個Fl片段中間。

（3）鑲嵌排列：兩種酶的Fd段彼此鑲嵌排列，由共同的Fl片段連接。

此外，應注意：

① 若第一種酶的單酶切片段數為F1，第二種酶切片段數為F2，雙酶切的片段數為F，則線形DNA的F=(F1+F2)-1，而環狀DNA的F=F1+F2。

② Fd通常等于幾個Fl之和。

（二）重組子的酶切分析

重組子是插入了外源DNA片段的載體分子。與空載的載體相比，其酶切圖譜出現了變化。所以，檢測疑是重組子的酶切圖譜可以幫助確定是否是真的重組子，并可以確定插入片段的插入方向，為基因克隆的結果鑒定和進一步的操作提供依據。

三、實驗內容

（一）酶切圖譜的構建

1、用兩種限制性內切酶分別對同一DNA分子進行完全單酶切。

2、取適量的單酶切產物用另一種酶進行完全酶切，得到雙酶切產物。

3、將以上酶切產物進行電泳，然后分析電泳結果，構建這兩種的酶切圖譜。

（二）重組子的酶切分析

1、提取疑是重組子的DNA，并用適當的限制性內切酶進行酶切。同時做非重組子對照。

2、分析酶切產物的電泳結果，繪制酶切圖譜，判斷是否是真重組子。

四、注意事項

1、實驗前必須查閱相關資料，了解和掌握雙酶切法的原理和構建圖譜的方法。根據所提供的材料設計詳細的實驗步驟，以達到最好的實驗結果。

2、實驗中應確保完全酶切，并獲得良好的電泳分離結果。

3、重組子分析時應在了解插入片段的一般資料的基礎上確定所需的限制性內切酶，并對酶切結果作出預期；最后用實驗結果進行驗證。