鈣調蛋白的粗分級分離實驗

上清 固體硫酸銨 濃硫酸 Tris 堿 緩沖液 B

聚丙烯燒杯 磁力攪拌器與攪拌子 聚碳酸酯離心管 超速離心機 帶刻度的聚丙烯量筒 粗棉布 聚丙烯漏斗 橡皮淀帚 刮勺 透析袋

材料與設備

上清，得自實驗 2(約 700~1000 ml)

固體硫酸銨

聚丙烯燒杯（2x4000-ml)

磁力攪拌器與攪拌子

聚碳酸酯離心管（6x500-ml)

超速離心機，備有 3000-ml 容積的轉頭

帶刻度的聚丙烯量筒（2x4000-ml)

粗棉布

聚丙烯漏斗（大的，寬嘴型）

濃硫酸（稀釋至 50%v/v 水溶液）

橡皮淀帚/刮勺

Tris 堿（1mol/L; 約 10 ml)

聚丙烯漏斗（小的，具長莖的）

透析袋（標稱截留分子量 6000~8000Da; 洗浄)

試劑

緩沖液 B(10x)(臨用前配制 4000 ml 1x 緩沖液 B，并加 2-巰基乙醇至 1 mmol/L)

(配方，見“試劑的配制”，PP.82~83)

操作程序

1) 以實驗 2 所得上清的體積為基礎（減去為測活而取出的等分試樣，于硫酸銨表 (見附錄 4) 上査出配成 0%~60% 飽和度所需的固體硫酸銨量。應為 361 g/L。稱取適量硫酸銨，并將團塊研碎成細粉 。

2) 將上清置 4000-ml 聚丙烯燒杯中，并放人大的磁力攪拌子。置冷室的大磁力攪拌器上慢慢攪拌。于 20 min 內緩慢抖動加人硫酸銨。如固體硫酸銨沉于燒杯底部，可停幾分讓其溶解。然后再繼續攪拌 40 min(即，共 60 min)。

3) 將混合物轉至 500-ml 聚碳酸酯離心管，平衡后，置超速離心機中，4°C,8000r/min 離心 60 min。

4) 移出上清，倒人鋪有兩層粗棉布的聚丙烯漏斗后收集于帶刻度的聚丙烯量筒中。棄去沉淀物。記錄上清液的體積。留 1% 的體積供以后測活用。你將需要這兩個體積作計算。

5) 將上清移至 4000-ml 聚丙烯燒杯。用 pH 計測量，中速攪拌，加 50%(v/v) 硫酸溶液，至 pH 達約 4.05。努力讓 pH 低于 4.1 髙于 4.0。

6) 燒杯置冷室, 攪拌 1h。

7) 將上清移至 500-m l 聚碳酸酯離心管。于超速離心機中，4°C,8000r/min 離心 60 min。

8) 移出上清并棄去。用橡皮淀帚，重懸沉淀物于幾毫升含幾滴 1mol/LTris 堿的蒸餾水中。應以最小的體積重懸沉淀物。

9) 戴上手套，將懸液轉移至透析袋。用具長莖的聚丙烯小漏斗灌人透析袋。排出過量的空氣，留出 50% 空余（透析袋應是癟的，無空氣）。透析袋兩頭至少打雙結扎緊或用夾鉗夾緊。

10)40°C 下，對蒸餾水透析 4 h, 其間換液一次。然后，轉至 4000 ml lx 綏沖液 B 中，繼續透析過夜（4°C)。在所有透析的情況下，均由小攪拌子在燒杯中緩慢攪拌，混勻透析液。不能讓攪拌子碰擊透析袋，否則透析袋會破裂。