一、引言天然的整合膜蛋白的量并不充足。因此對其的結構測定和功能分析需要:①重組膜蛋白的生產系統;②能分離得到有活性的膜蛋白（而不是沒有功能、折疊錯誤的膜蛋白）的純化策略。表達并純化原核和真核的膜蛋白在文獻中都有報道。讀者可以參考如Grisshammer 和Tate(1995;2003) 及Grisshammer和Buchanan(2006) 的文獻，也可以查詢本書的第35章。GPCR作為真核生物的整合膜蛋白，參與細胞間的交流和感覺信號轉導[見Gether和Kobilka(l998)]。本章是對GPCR 的專題討論。 對于如GPCR 的整合膜蛋白，本章不涉及其表達的所有可能策略細節，但是這里總結了一些關鍵點。①目前還沒有一個通用的可高效表達功能受體的策略。一些GPCR能高水平的積聚在細胞膜上，而其他某些相關的受體卻很難檢測到。而且雖然推測具有相似性，但在特定的表達宿主中的不同的 GPCR表現卻十分不同。所以GPCR 的重組表達仍然是一個反復實驗的過程。例如，在表達對比研究中，已經完成的嘗試包括使用甲醇營養型畢赤酵母(Andreetal.,2006)、桿狀病毒昆蟲細胞系統(Akermounetal_，2005) 和西門利克森林病毒系統（Hassaineetal.,2006)等。目前已經有了GPCR 在常用表達宿主表達的研究總結(Sarranmegnaetal.,2003)。②通常真核宿主似乎能夠比原核宿主更好的表達有功能的、嵌膜的 GPCR(Grisshammer，2006)。但有一些例外。例如，已經在大腸桿菌中成功表達了神經降壓素受體 NTSl(Grisshammeretal.,1993;Whiteetal.，2004)、M1蕈毒堿乙酰膽堿受體（HulmeandCurtis,1988)、腺苷A2a受體（WeiBandGrisshammer，2002) 和大麻素CB2受體632(Calandraetal.,1997;Yeliseevetal.，2005)。③已經有了很多關于重組表達整合膜蛋白的描述性報道。然而，目前只有少數文獻[見 Bonander 等 (2005;2009),Griffith等（2003);Wagner等（2006;2007)]討論了特定宿主細胞對于膜蛋白過表達的反應機制。 純化受體從概念上可以分成兩步: 第一步用合適的去污劑將受體從膜中提取出來 (增溶）; 第二步使用如常規的親和標簽、與該受體特異結合的配體層析柱、分子排阻色譜和其他方法純化受體。最重要的是，必須注意選擇實驗條件以保持膜蛋白在整個純化過程中處于活性狀態。這一點怎么強調也不過分，因為很多 GPCR—旦被去污劑從質膜中提取出來就會變得不穩定。 二、蛋白質增溶的一般注意事項提取嵌膜受體需要使用去污劑(詳見第34章）。去污劑的正確選擇對于長時間維持溶解受體的活性狀態非常關鍵。]V-十二烷基子1>麥芽苷（iV-Dodecyl-^^maltoside，DDM) 是溫和的非離子型去污劑，通常用于 GPCR 的增溶。添加脂樣的膽留醇半琥珀酸酯 (CholesteryIhemisuccimte) 可以提高受體的穩定性。短鏈的去污劑通常要比長鏈去污劑作用猛烈，但只要它們不損害要研究的GPCR 的完整性, 也是可以接受的。 溶解的受體必須被看成是去污劑-脂質-受體的復合物，而不是單純的受體蛋白質。 這意味著溶解后的受體的生化特性，如大小、形狀或等電點與單獨根據氨基酸序列計算出的結果是不一樣的。同樣，去污劑-脂質-受體的復合物不能被理所當然的當成是均質的。 因為在增溶過程中脂質與受體一樣結合去污劑，因此去污劑和膜的比例會決定受體周圍去污劑和脂質結合的量。在純化的過程中脂質和去污劑的結合量會發生改變。 增溶的過程必須優化，使其能夠在維持溶液中特定 GPCR 最穩定的同時得到最高的提取效率。通過放射性配體結合分析和總蛋白質含量測定，可以監測去污劑對加人的膜的系統變異 (systematicvariation) 效應。這需要計算實驗的 Bmax 值（nmol 功能性受體/mg 蛋白質) 并將其與純化的功能性受體的特異性結合的理論值相比較。如果沒有可用的功能性檢驗方法，則可以使用具有良好生化行為的如對稱的分子排阻層析譜作為受體完整性的指標。 因為在受體提取前可溶蛋白質已被去除，增溶之前的膜制備過程其實已經包含了一步初始的純化步驟，目的受體對污染物的比例也會因此提高。實際上在第一步純化過程中，受體也可從總細胞裂解物中而不是從溶解的細胞膜中富集。 三、蛋白質純化的一般注意事項1.去污劑溶液中 GPCR的穩定性很多GPCR 在去污劑溶液中都不是十分穩定 [除了視紫紅質 (rhodopsin)，只要其保持在非信號黑暗狀態（DeGrip，1982)]。導致不穩定的一個可能原因也許是 GPCR 結構上固有的柔性，即受體在去污劑溶液中具有多種構象, 而其中的一些構象會使蛋白質聚集。在純化過程中去除脂質也會引起不穩定。已經有很多方法用于提高 GPCR在去污劑溶液中的穩定性。例如，加入反向激動劑（inverseagonist)/抬抗劑（antagonist) 配體 (Cherezovetal.,2007；Hansonetal.,2008；Jaakolaetal.,2008；Warneetal.,2008)^使受體處于無信號失活狀態, 這通常比活性狀態更穩定 [見 Kobilka 和 DeUpi(2007)], 如膽甾醇半號 50 酸酯（cholesterylhemisuccinate) 的脂質或脂樣物質 (Jaakolaetal.,2008;”TuckerandGrisshammer,1996;WeiBandGrisshammer,2002) 和甘油（TuckerandGrisshammer，1996) 在純化中會提高受體的穩定性。定點突變也已經用于產生穩定性更高的GPCR(Magnanietal.,2008；Rothetal.,2008；Sarkaretal.,2008；Serrano-Vegaetal.,2008;Shibataetal.,2009), 因而能耐受更大范圍的去污劑。 2.一般的親和層析去污劑溶液中 GPCR的生化和藥理性質可以粗略地分為兩類。①由放射性配體結合分析和 G 蛋白核苷酸交換實驗 (Whiteetal.,2007) 評價，在優化的緩沖條件下, 能夠純化到活性形式的均質受體被稱為功能性受體。②在某些情況下（Kobilka，1995;Whiteetal.，2004)，存在去污劑可溶的卻不能結合特異性配體的受體種類。筆者把后一種稱為非功能性的、未正確折疊 (至少在受體識別方面) 但仍是去污劑可溶的受體種類。 重組克隆技術使得在給定受體的 N 端或 C 端引入常用的親和標簽變得容易。例如，受體 N 端的 Flag 表位標簽可用于 Ml 抗體親和層析柱 (Kobilka,1995) 或受體 C 端的多聚組氨酸尾用于固定金屬親和層析（immobilizedmetalaffinitychromatography,IMAC)(GrisshammerandTucker,1997；Hansonetal.,2008；HulmeandCurtis,1998；Jaakolaetal.,2008；Klaassenetal.,1999；Kobilka,1995；Warneetal.,2003；WeiBandGrisshammer，2002;Yeliseevetal.,2005)。一種識別牛視紫紅質 C 端的抗體層析柱（104311-tibody;MoldayandMacKenzie,1983) 可用于一步純化視紫紅質（Oprianetal.,1987;ReevesetaL，1”9) 和 C 端融合了 1D4 表位標簽的少腎上腺素能受體 (Chelikanietal.，2006)。 親和標簽的準確位置 (如遠離受體的跨膜核心或接近跨膜螺旋) 決定了受體和親和樹脂的結合步驟應該采用批量混合 (inbatch) 或采用柱上 (incolumn) 方式。太接近跨膜核心的親和標簽也許會部分地被受體蛋白周圍的去污劑層遮蔽，因此不易接近親和樹脂。 這種情況下長時間混合加載會更有效地捕獲受體 (WeiBandGrisshammer,2002)。而親和標簽暴露良好的受體可直接加載到樹脂填充的層析柱上，較短的暴露時間就能使純化標簽與親和樹脂結合。批量混合純化步驟必須手動操作，而層析柱加載可以自動操作 (WhiteetaL，2004)。雖然與蛋白質結合的去污劑的準確含量依賴于各去污劑的性質，但作為一般的指導原則，低臨界膠束濃度的去污劑比高臨界膠束濃度的去污劑在膜蛋白周圍形成更大的去污劑層 [見Bamber等 (2006)]。因此, 與高臨界膠束濃度的去污劑相比，低臨界膠束濃度去污劑會降低親和標簽與樹脂的可接近性。 許多實驗室使用 IMAC 作為第一步富集步驟。商品化的樹脂類型有 Ni2-NTA 樹脂（Ni2+-nitrilotriacetate,Qiagen)、Talon 樹脂（Co2+-carboxymethylaspartate，Clontech)和 IDA 樹脂 (iminodiacetate，Zn2+,Ni2+，Co2、GEHealthcare)。然而，不同 IMAC 樹脂的性質稍有不同 (WeiBandGrisshammer,2002)。例如, 與 Talon 樹脂相比，Ni2+-NTA 樹脂不僅能更強的結合目標膜蛋白，也會結合更多的污染物。受體的表達水平 (如目標受體和雜質的比例) 決定了第一步純化的效率。表達量越高, 第一步純化效率越高。用一步 IMAC 純化突變的/V 腎上腺素能受體能夠達到大于 90% 的純度（HansonetaL,2008)。 某些情況下，IMAC 樹脂結合去污劑增溶受體的能力低于與可溶蛋白質結合的能力 (WeifiandGrisshammer，2002;Whiteetal.，2004)。 純化的時間和步驟都應該保持到最小值，因為純化的所有階段都會引起蛋白質的損失。 3.受體-特異配體親和層析用一般的親和標簽富集受體之后，可能需要第二步純化以分離到純凈、有功能的受體蛋白。這主要是因為：①第一步純化得到的受體還不夠純, 仍有其他污染物。例如，用 XAaxanthineamineC0ngener，拮抗劑）層析柱純化腺苷受體可去除其中的一個主要污染物 (WeiBandGriSshammer，2002)。類似的, 用 NT[神經降壓肽 (neurotensin)，激動劑] 層析柱 (Whiteetal.，2004) 純化神經降壓肽受體 NTS1 可得到均一物質; 用阿普洛爾 (alprenolol，非選擇性, 腎上腺素能受體抬抗劑) 瓊脂糖層析柱純化，腎上腺素能受體。從一般親和樹脂上洗脫的受體可能包含功能性的和非功能性、錯誤折疊的受體，而后續受體_特異配體親和層析也能去除非功能性的受體部分。②一個 (或兩個連續的) 一般親和標簽步驟能得到幾乎純凈的受體，然而卻是功能性和非功能性受體的混合物。一般親和標簽不能從錯誤折疊但仍是去污劑可溶的受體中分辨出正確折疊的受體。受體的錯誤折疊可能發生在表達宿主中，也會因在去污劑溶液中不穩定而發生。受體-特異配體親和層析柱能夠從錯誤折疊的受體中分辨出有功能的受體。例如，阿普洛爾層析柱可被用于分離有功能的體-腎上腺素能受體 (Kobilka，1995)。③在粗溶的受體中加入生物素化的肽配體 (PACAP38) 及親和素樹脂，一步純化方案能夠制備高度富集的垂體腺苷酸環化酶促多膚 (pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide，PACAP)。 4.去污劑增溶 GPCR的分析去污劑增溶的、有功能的受體含量可以通過放射配體結合 (radioligand-binding) 實驗確定。理想狀態下，放射配體應以較高的親和力結合受體，并表現緩慢的解離速率，從而在從游離配體分離出配體-受體-去污劑復合物的過程中，能夠避免非平衡狀態中導致的可能的假象 (artifact) 產生。HUlme(1990) 概述了受體結合研究。對于具有親水性而不會摻人空的去污劑膠束的標記配體，放射配體結合分析的效果最好。相反, 疏水性的配體會插入空去污劑膠團而導致非特異的高背景信號。 推薦使用氨基黑分析法 (amidoblackassay)(SchaffnerandWeissmann,1973) 檢測蛋白質的含量。在去污劑和配體存在的條件下, 許多檢測蛋白質含量的方法不準確。氨基黑分析包含一個沉淀步驟用于去除去污劑、配體或其他緩沖成分。需要注意的是，不是所有的蛋白質與染料 (如氨基黑) 有相同的結合力，這意味著如果受體與染料的結合與參比蛋白質 (BSA) 不同，則蛋白質濃度測定也許會有偏差。 從配體結合數據和蛋白質含量分析，可以計算出 Bmax 的實驗值 (nmol 功能性受體/mg 蛋白質) 并將其與純的功能受體特異結合的理論值比較。需要注意的是, 因為不同的氨基酸組成理論值對每個 GPCR 都是特異的。如果實驗值與理論 Bmax 值匹配, 則說明純化到了活性受體。 四、增溶和純化重組神經降壓肽受體 NTS1NTSl 增溶、純化和分析的更詳細的描述見 White 和 GriSShammer(2007) 的文獻，這里主要討論其要點。NTSl 融合蛋白純品的獲得可通過聯合使用 IMAC 層析柱和 NTSl 特異配體層析柱實現。 將 NTSl 與麥芽糖結合蛋白 (mahose-bindingprotem,MBP) 融合可在大腸桿菌中實現具有功能的嵌膜 NTSl 表達（Grisshammeretal.,1993)。表達質粒編碼含信號肽序列的 MBP 及其后的受體。在大腸桿菌中前導肽酶去除信號肽后，用于純化的 NTSl 融合蛋白 MBP-T43NTR-TrxA-H10(NTSl-624) 的序列組成依次為: 成熟的大腸桿菌 MBP(Lys1 到 Thr366)、N 端截斷的大鼠神經降壓素 I 型受體NTS1(T43NTR，THr43 到 Tyr424)(Tanakaetal.,I”。）、大腸桿菌硫氧還蛋白（TrxA,Ser2 到 AlallM)[TrxA 會增加融合蛋白的表達量，見 Tucker和 Grisshammerd9%)] 和 10 個組氨酸標簽（HlO)(GrisshammerandTucker，B97)。表達在低溫 (22°C) 中進行，由一個低拷貝表達質粒的弱啟動子驅動。 這避免了新生受體鏈導致的大腸桿菌轉位和膜插入機制過載的可能性。在任何給定的時間點蛋白質產量都很少，但 2 天后就能觀察到積累的正確折疊的受體。純化 10 mg 的 NTSl 融合蛋白通常需要 250 g 濕重的大腸桿菌菌體，相當于 50L 的培養規模（Whiteetal.，2004), 這很容易通過發酵實現。 在大腸桿菌中 NTSl 融合蛋白的表達量處于中等水平（即污染物和目的受體的比值高）。因此，需要一個優化的能夠有效富集受體融合蛋白的 IMAC 方案。為達到這一目的，在 Ni2-NTA 層析柱純化中，采用了 10 個組氨酸殘基的 C 端標簽而不是 6f(GrisshammerandTucker,1997)。Ni2+-NTA 樹脂和 10 組氨酸標簽受體的緊密結合允許使用含 50 mmol/L 的咪唑的嚴格洗滌步驟。這個濃度的咪唑去除了結合于 Ni2-NTA 樹脂的絕大部分大腸桿菌的污染物，但不會洗脫目的融合蛋白。這一策略不僅可以從粗制的膜中有效的純化受體，而且也能很好應用于全細胞裂解產物 (GrisshammerandTuck-er，1997)0NiB 緩沖液中的高鈉離子濃度和高咪唑濃度會減弱 NT 和 NTSl 的親和力, 從而會阻礙從 Nia-NTA 層析柱上洗脫下的功能性受體與 NT 層析柱的直接結合。因此須用緩沖液將 NaCl 和咪唑的濃度從 200 mmol/L 稀釋到 70 mmol/L，以使功能性的 NTSl 能夠結合到 NT 層析柱上。NTSl 和 NT 的結合對 NaCl 敏感，可用高濃度的 NaCl 將受體從 NT 層析柱上有效的洗脫下來(圖 36.1)。
 1.NTSl 融合蛋白的增溶(1) 除非另有說明，所有的步驟均在 4°C 或在冰上操作。 (2) 室溫下用錘子壓碎塑料薄板之間的 250 g 冷凍細胞。將細胞放入 Waring 攪拌器。 (3) 加人 500 mL 冷的 2X 增溶緩沖液 [100 mmol/LTris-HCKpH7.4)、60%(V/V) 甘油、4OOmmol/LNaCl]。運行攪拌器使細胞充分重懸。 (4) 將細胞懸液轉人有磁棒的燒杯中。由于攪拌器會將空氣引入懸浮液，這一步很難確定體積。因此最終的體積在第 (11) 步調節。 (5) 在攪拌的過程中，加入蛋白酶抑制劑儲備液各 ImL(PMSF,70 mg/mL 溶于乙醇; 亮抑酶肽，Img/mL 溶于水; 抑肽素 A,l.4 mg/mL 溶于甲醇)、5 mLImol/LMgCl2(終濃度為 5 mmol/L)、0.6 mLDNaseI 溶液（10 mg/mL,SigmaD-4527)和 50 mL 冷 H20。 (6) 在攪拌的過程中，滴加 100 mLCHAPS,/CHS 儲備液 [6%(w/V)(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-l-propanesulfonate)/1.2%(m/V)cholesterylhemisuccinateTrissaltinH20]。CHS 自身不溶于水，需要在 CHAPS 中溶解。 (7) 在攪拌過程中，滴加 100 mLDDM 儲備液 [10%(W/V) 水溶十二烷基-1-麥芽糖苷]。 (8) 繼續攪拌 15 min。 (9) 超聲 33 min(8s/g 細胞），1s 開，2s 關，第 4 級 (Misonix 公司超聲波破碎儀，0.5 英寸，平底探頭）。保持樣品處于冰水浴以避免超聲過程中局部加熱。這一溫和的超聲步驟能加強受體的增溶效率。 (10) 每種蛋白酶抑制劑額外各加人 ImL。 (11) 邊攪拌邊滴加冷的 H2O 至終體積 IL。 (12) 再攬拌樣品 30 min。 (13) 超速離心樣品 1 h[Beckman45Ti 轉子或同等轉子，45000r/min(235000 g 于 Fmax)]。 (14) 回收增溶后受體 (上清液中）。 (15) 邊攪拌邊滴加咪唑儲備液 (2moLL, 用 HCl 調節到 pH7.4, 終濃度 50 mmol/L)。0.22pm 濾器過濾樣品。此時可用 IMAC 層析柱和神經降壓素親和層析柱從此上清液中純化受體。 2.固定化金屬親和層析純化 NTSl 融合蛋白此純化可用 AktaPurifier(GEHealthcare) 層析系統的兩柱模式在冷室全自動完成，細節詳見 White 和 Grisshammer(2007)及 White 等(2004)的文獻。純化儀裝備有氣體傳感器、樣品泵 P950、改良的進樣閥、一根 100 mL 的 Ni2+-NTA 層析柱、一根 20 mL 的 NT 層析柱和分離組分收集器 Frac950。所有的純化步驟也可用更簡單的設置操作，即先用 IMAC 層析柱純化，隨后將 Ni2+-NTA 層析柱的洗脫液稀釋后再上樣加載到 NT 層析 展開 | 