3. 2 復性及重折疊
經過初步純化的RRhP I 通過Sephadex G225柱層析脫尿素并轉換緩沖液為50 mmo l?L 甘氨酸2N aOH, pH9. 5。層析圖譜(見圖3) , 有2 個層析峰,峰2 主要為折疊趨于正確的單體RRhP I, 收集峰2。進行SDS2PA GE 分析。結果(見圖2) 顯示, 收集的RRhP I 樣品中高分子量雜蛋白的含量有所減少。峰1 為高分子量雜蛋白和RRhP I 的二聚體或多聚體及折疊不完全或不正確的RRhP I。
3. 3 RRhP I 酶切轉化h I
在收集的RRhP I 單體組分中, 加入2. 5 mmo l?L 還原型谷胱甘肽和0. 25 mmo l?L 氧化型谷胱甘肽以控制2SH 比例, 通過二硫鍵的交換形成穩定的具有天然結構的RRhP I。在37℃條件下, 用胰蛋白酶(1?500, 酶?RRhP I 底物) 和羧肽酶B (1?1000, 酶?RRhP I 底物) 協同酶切30～ 40 m in, (H is) 62A rg2A rg 和C 肽被準確切除, RRhP I 轉化為h I。SDS2PA GE 結果表明, RRhP I 幾乎被完全酶切轉化為h I, 主要電泳條帶的位置從13 KD 附近下移至與人胰島素標準品平行的位置, 見圖2。
3. 4 h I 的純化
用0. 1 mo l?L ZnCl2 沉淀的h I 粗產品可通過Superdex 75 進行純層析圖譜見圖4, h I 主要集中在峰3。收集峰3 進行SDS2PA GE 分析, 結果顯示, 見圖2, 所得h I 組份在SDS2PA GE 分析中是均一的,只有一條蛋白帶。將峰3 組分透析, 濃縮并凍干, 即可最終制得h I。
3. 5 產品的性質鑒定
3. 5. 1 SDS2PA GE 分析 結果(見圖2) 表明, 本研究得到的產品的分子量與h I 標準品相同, 且純度較高, 在SDS2PA GE 中呈一條蛋白帶。3. 5. 2 HPLC 分析 本工藝制備的重組胰島素制品主峰的保留時間(27. 757 m in) 與標準品h I 的保留時間(27. 968 m in) 基本一致, 而與豬胰島素的保留時間(25. 437 m in) 有明顯差別。
圖4 Superdex 75 純化hI
Fig 4 Gel f iltration of hI on Superdex 75Peak a and peak b: impurities, Peak c: h I
3. 5. 3 氨基酸組成分析 分析結果見表2, 該結果表明本工藝制備的重組胰島素樣品的氨基酸組成與h I 基本一致。樣品中不含M et, 與胰島素原一起表達的(H is) 62A rg2A rg 已被準確切除, 樣品中只剩下1 個A rg 和2 個H is, 這表明RRhP I 已被成功地轉化成了h I。
3. 5. 4 h I 整體生物活性的鑒定 5 只昆明種清潔級小白鼠(雄性20～ 24 g) , 按每20 g 體重皮下注射h I 樣品1. 25 U , 注射后2 h 內均出現降血糖陽性反應, 其中有4 只驚厥。隨即腹腔注射1m l 5% 葡萄糖注射液, 驚厥現象消失。這表明本工藝制備的h I 樣品具有很好的降血糖活性。
4 討 論
4. 1 RRhP I 的初步純化
為了快速準確地從大量的雜蛋白中捕獲目標產品, 特異性極高的親和層析是一個理想的選擇。通過專一性識別RRhP I 中的6 個組氨酸殘基, N i2+ 2N TA 親和層析可以一步純化目標產物RRhP I[ 3 ]。但是,N i2+ 2N TA 親和介質較昂貴, 勢必增加生產成本, 所以在實際生產中很難推廣應用, 只能用于表達篩選。為了降低成本, 本研究選用相對便宜的DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析初步純化目標產物RRhP I。通過精心篩選層析條件, 目標產物的純化效果較好, SDS2PA GE 分析結果顯示, 電泳條帶主要集中在MW 13 KD 左右, 收率達77. 5%±1. 81% (n= 6)。目前尚未見采用國產DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析純化重組胰島素產品的相關報道。
4. 2 復性及酶切轉換
以包涵體形式表達的RRhP I 由于二硫鍵配對錯誤, 水溶性很差, 在進行DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析時, 為了增加RRhP I 的溶解度, 緩沖液中加入了大量的脲素, 此時RRhP I 處于變性環境中。因此, 在雙酶切轉化之前必須首先除去尿素, 使RRhP I 復性。本研究用Sephadex G225 層析去除變性劑, 可有效防止蛋白的聚集, 并誘導變性蛋白RRhP I 向其天然態折疊。在我們所采用的條件下進行層析, 得到2 個層析峰, 峰2 為折疊趨于正確的單體RRhP I。其中的高分之量雜蛋白有所減少。峰1為高分子量雜蛋白、多聚RRhP I 及折疊不完全或不正確的RRhP I。對這一部分進行再層析和折疊反應, 可以提高折疊的總收率。由此可見, 此步層析可達到純化, 去除變性劑和誘導復性的三重效果。在體內, 參與胰島素原轉化過程的有兩種Ca2+依賴的內肽酶以及羧肽酶H。在體外, 用胰蛋白酶和羧肽酶B 協同酶切同樣可將胰島素原轉變成胰島素[ 4, 5 ] , 這使得通過E. co li 表達人胰島素原制備人胰島素成為可能。在本研究構建的表達產物中, 引導肽(H is) 6 與胰島素原之間插入了兩個A rg, 這與C肽和胰島素之間連接的方式是相同的, 因此在雙酶切轉化的同時, (H is) 62A rg2A rg 可以被準確去掉,不必另外采用其它的處理方式, 從而減化了后處理過程。在本研究所選用的酶切條件下, RRhP I 被準確有效地轉變成了h I。SDS2PA GE 分析顯示, 酶切較完全, 主要電泳條帶從13 KD 附近轉移到了與人胰島素標準品平行的位置。
4. 3 胰島素純化
目前人們普遍使用制備型HPLC 進行基因工程產物的最后一步純化[ 6～ 8 ]。這是因為HPLC 具有操作方便快捷, 分辨率高, 產品純度能一次性達到臨床要求等優點。但是HPLC 具有對軟硬件的要求較高, 前期投入大, 純化量有限等等缺點, 從而使生產能力受到影響。本研究在最后純化制備人胰島素時選用的Superdex 75 分子篩層析, 其具有機械強度高, 穩定性好, 重現性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨率高(13 000 p lates?m ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m l?m in, 25℃) , 且可在低壓下操作, pH 范圍廣(3～12) , 分離范圍廣(球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特異性吸附小, 負載量大, 層析條件易控制等等優點, 是一個非常理想的純化基因工程產品的層析方法。用0.2 mo l?L 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0 的緩沖液作平衡液和
洗脫液, 將h I 粗品經過Superdex 75 柱層析后, 我們得到了純度較高的人胰島素制品, SDS2PA GE 分析樣品只有一條帶。目前尚未見采用Superdex 75純化基因工程產品的有關報道。胰島素是天然生物活性物質, 必須保持天然的二級結構才能發揮降血糖的生物活性。小鼠驚厥實驗的陽性結果充分表明, 本研究所選擇的層析條件不但有效地純化了表達產物, 而且有效地防止了目標產物h I 的失活變性, 本研究最終制備了純度較高的具有天然活性的基因工程人胰島素。