夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為：
將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體；
加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結；
洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原專一的一次抗體，與待測抗原進行鍵結；
洗去多余未鍵結一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結；
洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果。
間接法常用于檢測抗體，一般的操作步驟為：
將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原；
加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗體，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結；
洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗體，與待測的一次抗體鍵結；
洗去多余未鍵結二次抗體，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗體的含量。
競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：
將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體；
加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結；
加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進行專一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗體數量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗體鍵結，即所謂競爭法之由來；
洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。
當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。