操作簡便，不需要特殊儀器（酶聯檢測儀）。
【試劑及配制】
(1) 稀釋液：為1%A的0.01mol/L pH7.4的。
(2) 封閉液：為2% A的0.01mol/L pH7.4的。
(3) 洗滌液：為0.5% Tween 20的0.01mol/L pH7.4的。
(4) 底物溶液：見附錄。
【操作方法】
(1) 取適當大小NC膜（0.3mm、0.45mm和0.65mm均可），用鉛筆畫好5mm′5mm的加樣方格，并作好相應標記
(2) 將NC膜浸入0.01mol/L pH7.4的中15~30min，取出用濾紙吸干；
(3) 將標準抗原和待檢樣本點加于NC膜，室溫干燥；若估計待檢樣本抗原量較少，可重復點加。有條件者可用dot-blot點膜器點樣；
(4) 將NC膜浸入封閉液中振搖封閉30min。此步驟至關重要，不可省略；
(5) 將NC膜浸入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次30min，取出用濾紙吸干；
(6) 將NC膜浸入酶標抗體溶液中，振搖反應30min；
(7) 重復步驟（5）；
(8) 將NC膜浸入底物溶液中，振搖顯色15~20min；
(9) 用流水沖洗數分鐘，放入蒸餾水中終止反應；
(10) 根據顯色反應有無或顏色深淺，進行定性或半定量。
【注意事項】
(1) 包被用的抗原或抗體的蛋白濃度一般為1.0~10mg/ml，但最好是預先經過方陣法滴定選擇其最佳工作濃度。
(2) 在包被后，用1~5% A或5%~20% 進行封閉至關重要，不可省略。因為用抗原或抗體包被后，固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點，在隨后反應中，會引起非特異性吸附，導致本底偏高。
(3) 已包被好的酶標板在經過洗滌后，加入0.01mol/L pH7.2的Tris-HCl緩沖液（含0.2%的NaN3）或10%硫酸銨溶液(用Tris-HCl緩沖液配制)，在4~6℃或室溫下可保存3個月。
(4) 加底物前甩干的酶標板在空氣中暴露的時間越長，吸光度越低。因此切忌在操作中將大批反應板洗滌后一次甩干，任其在空氣中干燥。
(5) 聚乙二醇（PEG）可增強抗原抗體反應，促進可溶性免疫復合物的沉淀。在待測血清和酶結合物的稀釋液中加入40g/L PEG6000可顯著縮短反應時間。
(6) 在行雙抗體夾心法時，不能只用一種mAb，而應選擇針對不同抗原表位的兩造mAb。