酵母DNA微量制備

實驗概要

本實驗介紹了分別從40ml和5ml酵母培養液中制備酵母DNA的操作流程。

實驗步驟

1. 酵母DNA微量制備(40ml)

   1) 在125ml三角瓶中用40ml YPD培養液在30℃條件下培養細胞達最大生長量(過夜)。

   2) 將上述培養物移入螺蓋離心管，用醫用離心機或Sorvall SS-34轉頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。

   3) 將細胞懸浮在3ml的0.9mol/L山梨醇-0.1mol/L Na₂EDTA(pH7.5)溶液中。

   4) 加0.1ml的2.5mg/ml消解酶100T，置37℃條件保溫1小時。

   5) 用醫用離心機或Sorvall SS-34轉頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。

   6) 將細胞重新懸浮在5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L醋酸鈉溶液中。

   7) 加0.5ml的10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混勻。

   8) 置65℃保溫30分鐘。

   9) 加1.5ml的5mol/L醋酸鉀溶液，在冰浴上放置1小時。

   10) 用Sorvall SS-34轉頭以1000r/min離心10分鐘。

   11) 將上清液轉移至干凈的塑料離心管中，室溫下加入兩倍體積的95％乙醇，混勻，以5000～6000r/min離心15分鐘。

   12) 棄上清液，將沉淀物干燥，然后懸浮在3ml TE緩沖液(pH7.4)中，此操作可能需要幾個小時。

   13) 用Sorvall SS-34轉頭以1000r/min離心15分鐘，將上清液轉移到一個新試管，棄沉淀物。

   14) 加入150μl的1mg/ml RNaseA溶液，在37℃下保溫30分鐘。

   15) 加入一倍體積的100％異丙醇，輕輕混勻，取出呈松散纖維狀的沉淀物，無需離心，讓其自然干燥。

   16) 將沉淀物懸浮在0.5ml TE緩沖液(pH7.4)中，置4℃保存。酵母DNA的最終濃度約為200μg/ml。如果最后的溶液混濁不清，用異丙醇再次沉淀DNA或用Sorvall SS-34轉頭以1000r/min離心15分鐘。

2. 酵母DNA微量制備(5ml)

   1) 按酵母于5ml YPD中，置30℃培養過夜。

   2) 用醫用離心機以2000r/min離心5分鐘沉淀細胞，棄上清液。

   3) 將細胞懸浮在0.5ml的1mol/L山梨醇-0.1mol/L Na₂EDTA(pH7.5)緩沖液中，轉動一支1.5ml離心管中。

   4) 加入0.02ml的2.5mg/ml的消解酶100T溶液，置37℃保溫1小時。

   5) 離心1小時。

   6) 棄上清液，把細胞懸浮在0.5ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)-20mmol/L Na₂EDTA溶液。

   7) 加0.05ml的10％ SDS，混勻。

   8) 置65℃保溫混合物30分鐘。

   9) 加0.2ml的5mol/L醋酸鉀，把離心管在冰浴中放置1小時。

   10) 離心5分鐘。

   11) 將上清液轉移到一潔凈微型離心管，室溫下加入等體積的無水異丙醇，混勻，放置5分鐘。短暫離心(10秒鐘)棄上清液，讓沉淀自然干燥。

   12) 用0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮沉淀。

   13) 加入15μl的1mg/ml的RNaseA溶液，置37℃保溫30分鐘。

   14) 加0.03ml的3mol/L醋酸鈉，混勻，用0.2ml的無水異丙醇沉淀，再短暫離心收集DNA。

   15) 棄上清液，自然干燥，用0.1～0.3ml TE緩沖液(pH7.4)重新懸浮DNA。

   16) 在使用限制性內切酶酶解DNA之前，有必要將最終濃度溶液離心較長時間(15分鐘)以便除去可能抑制酶解的不溶性物質。