構建LacZ融合載體研究酵母菌基因調控。由于這種檢測方法簡便而且靈敏度高，因此，酵母菌基因經常以LacZ基因的功能 部分作標簽，來指示待研究酵母菌基因的表達調節功能。融合蛋白被這樣構建：酵母基因的啟動子加上這個基因編碼蛋白的N端的幾個氨基酸殘基融合在LacZ基因的羧基 端，由此編碼的蛋白質片段仍保持著β-半乳糖苷酶的活性。在構建LacZ融合基因時，關鍵是基因融合的連接處要保證蛋白質翻譯讀框的正確性。來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版
| 實驗材料 | 包含lacZ融合基因的酵母菌株 |
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| 試劑、試劑盒 | 選擇培養基平板液氮Z緩沖液20 mg mL×-gal溶于二甲基甲酰胺 |
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| 儀器、耗材 | 30℃孵育箱圓形硝酸纖維素濾膜Whatman 3MM 濾紙 |
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| 實驗步驟 | 1)在含有適當選擇培養基的培養平板上點接種或者劃線接種酵母菌克隆，在30℃培養
直至生長到理想的大小（一般需要48 h)。
設置雙份檢測有助于提高結果的可靠性。
2)將一個圓形的硝酸纖維素濾膜置于平板上方，輕輕地壓在平板的表面，使所有的菌落轉移到膜上。這一步建議使用加強型硝酸纖維素濾膜并且要輕輕地操作，因為放在液氮里之后它們會變得非常脆。
3)小心地揭下濾膜，將其置于一裝有液氮的淺盤子中，液氮能剛好覆蓋一張濾膜即可。
4)使用寬壓舌板之類的工具小心地將濾膜從液氮中取出，將濾膜置于干燥的Whatman 濾紙上，在室溫解凍（<5min)。
5)將另一張Whatman濾紙剪成圓形，放在一個培養皿里。加入3?5 mL含有1 mg/mLλ-gal的Z緩沖液，使液體剛好能夠浸透濾紙但不能淹沒濾紙。把解凍的硝酸纖維素濾膜放在Whatman濾紙上，使緩沖液慢慢地被吸收到濾膜上。
如果Whatman濾紙被緩沖液淹沒，會導致菌落擴散，使篩選的結果無法解釋。
6)將培養皿放在30℃，溫育幾分鐘至過夜，直到陽性菌落變為藍色。 展開 |
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