1、集落的種類:
不同細胞來源的集落其形態和大小均有所不同.
2、各種集落的培養步驟:
各種造血細胞集落的培養條件有所不同,但其培養過程大致相似,操作步驟大致如下。
分離所要培養的細胞,制成單個核細胞懸液。
配制相應的培養體系。按比例將細胞因子、營養素以及血清等加入到培養 基中形成特有的培養體系,培養體系最好在37℃水浴中保溫10min。
將瓊脂等支持物煮沸融化,如是甲基纖維素則不需此步驟,待融化的支持 物溫度降到40℃時,加入培養系混勻。
將充分混勻的培養體系加入培養皿或培養板的孔中,一把種3個復孔。
將培養皿或培養板置于37℃、5%CO2飽和濕度環境下培養。
觀察結果,不同的集落計數的時間有所不同,詳見下述。
3、粒-單核-巨噬系細胞集落的培養:
以往CFU-GM培養的刺激物多用人白細胞、胎肌以及胎盤裂解液作為條件培養基等,現多用造血生長因子替代。這些細胞因子包括GM-CSF、G-CSF、M-CSF以及IL-3等,但常用GM-CSF。培養基多用IMDM,RPMI等,培養基常用瓊脂以及甲基纖維素,但效果前者較好。
培養體系包括20%-30%胎牛血清,50ng/mlGM-CSF,細胞懸液中細胞總數一般以(1-2)X10^5/ml為宜,其余用IMDM或RPMI補齊,但保持瓊脂終濃度為0.3%,甲基纖維素終濃度為0.9%-1.0%。細胞一般置于直徑為33mm的培養皿或6孔板中,于37℃、5%CO2飽和濕度環境下培養。
(1)集落計數 一般培養10-14天觀察集落,大于40個細胞的細胞團為一個集落。
(2)集落形態一般CFU-GM的形態分3種。
致密型細胞緊密成團,細胞個體較小,對為粒細胞為主的集落。
混合型細胞團中央為緊密成團的粒細胞,周圍彌散分布著單核細胞或巨噬細胞。
松散型細胞團比較均勻地分散,細胞個體較大,多為單核細胞和巨噬細胞組成。
4、紅系集落的培養:
(1)集落培養體系CFU-E的培養需要EPO,BFU-E的培養需要PHA-LCM、再生障礙性貧血患者血清或IL-3等,培養基主要為IMDM,幾種培養體系見表6-5.
(2)培養方法配制好的體系加入直徑為33mm的培養皿或6孔板中,37℃、5%CO2飽和濕度環境下培養。
(3)集落計數一般CFU-E在培養的第5-7天觀察計數,大于8個細胞的細胞團為一個CFU-E集落。BFU-E在培養的第14天計數,大于50個細胞組成的細胞團或3個中心以上的細胞團為一個BFU-E集落。
(4)集落的鑒定在倒置顯微鏡下,CFU-E及BFU-E集落一般呈鮮紅色,易于和其他集落比較。
應用集落染色法進行鑒定。因為紅細胞的血紅蛋白具有類似過氧化物酶的作用,可使二甲基聯苯胺和過氧化氫反應而形成棕紅色,借此可與其他集落相鑒別。
首年稱取1g二甲基聯苯胺,融解于100ml無水乙醇中,配制成1%二甲氧基聯苯胺溶液,再配制H2O2工作液,即在0.9ml的蒸餾水中加入0.ml75% H2O2。
染色工作液的配制:每5ml1%的二甲氧基聯苯胺溶液中加入H2O2工作液0.2ml并混勻。染色時首先在培養物中加入適量的PBS或生理鹽水,10-15min后,加入染色工作液,染色10-15min后,在倒置顯微鏡下觀察計數染色成紅色的集落為紅系集落。
直接用吸管取出單個集落圖片進行鑒定。首先用酒精燈或酒精噴燈在玻璃滴管前端1cm處,加熱彎曲成直角,在滴管內吸取少許等滲液,在倒置顯微鏡下輕輕吸去單個集落,并吹至用多聚賴氨酸處理過的玻片上,輕輕涂開晾干。滴加1%二甲基聯苯胺,3min,后滴加3%
H2O2作用1min。蒸餾水漂洗,再用蘇木素染色6min,1%鹽酸酒精脫色5min,水洗干燥后鏡下觀察。紅系集落染色后胞漿呈橘黃色。也可用單克隆抗體進行酶標鑒定。如應用血型糖蛋白A等。
5、巨核細胞集落的培養:
巨核細胞含量較低,集落不宜鑒別。其集落培養的刺激物只要有TPO、IL-3、IL-6、SCF、PHA-LCM以及再生障礙性貧血患者的血清等。主要培養體系見表6-6.
上述培養體系用培養基補足后加入培養皿或培養板的孔中,于37℃、5%CO2飽和濕度環境下培養7-14天,進行CFU-Meg集落計數,>3個細胞為一個CFU-Meg集落。培養21-24天,進行BFU-Meg集落計數>50個細胞或3個中心以上為一個BFU-Meg集落。集落鑒定:簡要介紹應用直接酶標法對血漿凝塊法培養的CFU-Meg集落進行鑒定的方法。
在培養皿或培養板的孔的培養物中加入甲醇/丙酮(1:3),固定20min,PBS漂洗,然后室溫干燥,不及時染色時可置-20℃保存。
用含2%馬血清的PBS室溫孵育15min后吸去血清。
滴加10-20ul鼠抗人的IIb/IIIa單抗(一抗),室溫孵育1h,PBS漂洗2次。
滴加10-20ul生物素結合的兔抗鼠二抗,室溫孵育30min,PBS漂洗2次,
將標本浸于含1%過氧化氫甲醇溶液中,室溫孵育1h,以消除內源性過氧化物酶,再用PBS漂洗2次。
滴加ABC試劑,孵育40min后予以充分洗滌。
DBA顯色10min,PBS洗2次。
蘇木素染色2min,水洗后自然干燥,鏡鑒。陽性細胞為棕紅色或棕黑色。
6、混合集落的培養:
混合集落是指集落中含有兩系、三系和四系細胞的集落,一般是指三系以上的集落。培養方法預計培養體系與BFU-E和CFU-Meg相似,一般于14-18天觀察。
7、高增殖潛能集落形成細胞的培養:
HPP-CFC是比較原始的造血祖細胞,在骨髓中含量極低,其生物學特性有以下幾點。
可重建受致死劑量照射小鼠的骨髓造血。
具有想粒系、紅系、巨核系以及巨噬系等多項分化的能力。
具有抵抗體內外細胞毒藥物5-FU的作用。