質譜技術在腫瘤蛋白質標志物研究中的應用與發展

20世紀基因組學研究取得的巨大成就為蛋白質組學的發展奠定了基礎。蛋白質組學是從整體水平上分析生命體、組織或細胞的蛋白質組成及其活動規律的科學，以基因表達產物為研究對象，延伸了基因組學研究深度，更深層次地揭示了生命活動規律。蛋白質組學的研究內容主要包括蛋白質表達存在方式(修飾形式)的鑒定、結構與功能分析、蛋白質定位、蛋白質差異表達以及蛋白質間相互作用分析等[1]。目前蛋白質組學研究技術主要包括：二維電泳技術、蛋白質芯片技術、質譜技術等[2]。其中，二維電泳技術是早期蛋白質組學的重要技術之一，但是由于實驗步驟多，耗時長，重復性差等特點，已經逐步被新型技術所取代。蛋白質芯片技術是將多種蛋白質純品點于芯片表面，形成蛋白質矩陣進行免疫等標記反應，主要受限于很多蛋白質無法獲得純品而不能用于芯片制備。質譜技術由于靈敏度高、特異性強、分析范圍寬等優點逐漸成為蛋白質組學的主要研究手段，可以對特定生命過程中的功能性蛋白質分子進行定性和定量檢測，因此在基礎科研和臨床研究中得到了廣泛的應用[3,4]。

一、基于質譜的蛋白質組學技術

1．基于質譜的蛋白質組學定性技術：

蛋白質定性鑒定的基本原理在于：蛋白質組的基本序列已經通過基因組學信息獲得，可以用來鑒定多肽的氨基酸序列，并且獲得多肽與蛋白質的對應關系[1]，即質譜提供的多肽碎片數據可以與蛋白質數據庫自動匹配來確定多肽序列與蛋白質歸屬。基本技術策略分為：(1)自上而下(Top–down)策略[5]，即完整蛋白質在質譜中進行分析，可以提供完整蛋白質的質量數，但是由于質譜儀受到質量分析范圍的限制，此方法在常規實驗室不易實現。(2)自下而上(Bottom–up)策略[6]，即蛋白質被蛋白酶水解成多肽，然后對多肽進行質譜分析和碎裂。基于這條策略的大致步驟為：蛋白質樣品首先經過酶解降解為多肽，然后對多肽進行色譜–質譜分離與鑒定，最后通過搜索引擎(MASCOT：http：//www.matrixscience.com/server.html, SEQUEST：http：//fields.scripps.edu/sequest等)在公共蛋白質組學數據庫(SWISS–PORT: http：//web.expasy.org/groups/swissprot, NCBI：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed等)中自動完成質譜數據的解析，確定多肽序列與蛋白質種類。該技術靈敏度高，特異性好，儀器自動化程度高，可以鑒定出生物樣品中成千上萬種蛋白質，被認為是大規模、高通量蛋白質定性檢測的首選方法。

2．基于質譜的蛋白質組學相對定量技術：

對于大多數生命科學和醫學研究來說，僅完成樣品中蛋白質組的定性研究是遠遠不夠的，還需要對蛋白質組進行定量分析。由于組學的研究對象是多個蛋白質，單次檢測很難實現所有蛋白質的絕對定量，因此蛋白質組學定量多為相對定量檢測。蛋白質組學定量的質譜技術包括譜圖計數、質譜峰強度定量、同位素定量技術等。其中使用同位素作為內標定量的方法是目前質譜定量的最佳手段，即對整體蛋白質組進行同位素標記，并使用每一種天然蛋白質與同位素蛋白質的比值進行相對定量分析。主要分為細胞層面標記和蛋白質層面標記兩種技術路線：(1)細胞層面標記的細胞培養氨基酸穩定同位素標記(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)方法[7]：即在兩種細胞樣品中分別加入輕重同位素標記的培養基，經過傳代培養后，兩種細胞樣品中的全部蛋白質中分別嵌合了輕重同位素，可以在質譜上根據同位素的不同質荷比直接判斷樣品來源并進行定量比對。(2)蛋白質層面標記：使用含有同位素的小分子與樣品全部蛋白質直接標記，如同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)[8]、同位素編碼親和標記(isotope–coded affinity tag，iCAT) [9]、18O標記[10]等方法，此類方法使用帶有穩定同位素的小分子與特定氨基酸側鏈反應，使得多個樣品可以分別連接含有不同同位素個數(多至8個)的小分子，從而產生一級數據相同但是二級數據不同的質譜譜圖，通過二級譜圖強度比對進行多個樣品的定量分析。

3．基于質譜的目標蛋白質絕對定量技術：

質譜技術對目標蛋白質的絕對定量檢測主要通過質譜多反應監控技術與同位素多肽內標技術聯用來實現[11]。該方法首先選定目標蛋白質的一個或多個多肽，合成序列相同但含有穩定同位素的多肽作為內標，定量加入樣品中，通過監測特定多肽及其同位素多肽的質譜峰強度進行比對和計算獲得目標蛋白質的定量值。質譜多反應監控技術通過進行母離子篩選與子離子篩選等二次選擇過程，篩選出目標蛋白質，而非目標蛋白質由于無法通過篩選達到檢測器，極大降低了噪音干擾。因此，此方法針對性強，本底噪音低，是目前質譜技術中定量能力最好的一種，可以控制變異系數小于15%，檢測限低至納克每毫升，適合血液、組織等臨床樣品的定量檢測[11]。

二、質譜技術發現腫瘤蛋白質標志物

質譜技術作為一項強有力的研究工具在科學研究中發揮著巨大的作用，特別在腫瘤相關研究中，目前已經獲得美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的腫瘤標志物包括多種蛋白質前列腺特異性抗原(prostate–specific antigen, PSA), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA), 人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her–2), 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG), 糖類抗原CA125等，均揭示了蛋白質與腫瘤發生發展密切相關。這些已有成果極大促進了質譜技術在腫瘤蛋白質標志物研究中的應用，并取得了標志性進展。例如：美國約翰霍普金斯大學的Chan課題組發現了新型卵巢癌蛋白質標志物，他們使用表面增強激光解析電離質譜技術(surface enhanced laser desorption and ionization time–of–flight mass spectrometry, SELDI–TOF MS)技術對503個婦女的血清進行了蛋白質組學的分析[12]，在隨后的大量臨床驗證中最終確定CA125、β2微球蛋白，轉鐵蛋白，甲狀腺運載蛋白和載脂蛋白A1的聯合檢測可以作為卵巢癌的新型臨床診斷指標。2009年9月該試劑盒OVA1(商品名稱：http：//ova–1.com)獲得了美國FDA的認證，進入臨床使用，被認為是國際腫瘤蛋白質標志物研究的重要標志性成果。

同時，腫瘤仍然是國際上致死率最高的疾病之一，缺乏早期檢測技術和有效治療方案，臨床中還存在著大量問題需要解決，新型標志物的研發迫在眉睫。由于腫瘤蛋白質標志物研究的難度大，風險高，因此近十年來僅有幾例試劑盒獲得了美國FDA批準，進入臨床使用。大量標志物研究還停留在論文研究水平，其中臨床問題、研究思路和技術方案的選擇直接關系到研究的成功與否。

1．臨床問題選擇：

在腫瘤蛋白質標志物研究中，臨床問題的選擇是研究核心。在腫瘤研究中，需要解決的臨床問題往往包括腫瘤早期檢測、腫瘤分期檢測、治療方案與藥物選擇、療效評估等多個方面。研究者需要根據不同腫瘤的臨床情況，具體分析并凝練不同腫瘤的主要臨床問題。例如，對于病程發展快、五年存活率低、沒有有效手術或化療手段的腫瘤，早期診斷是研究重點，如胰腺癌、卵巢癌、肺癌等；對于病程發展慢、手術效果明顯的腫瘤，腫瘤的愈后與復發是需要關注的問題，如前列腺癌、腸癌等；還有一些腫瘤有特殊的檢測需求，如乳腺癌雖然有臨床有效的雌激素受體(estrogen receptor，ER)，孕激素受體(progesterone receptor，PR)，HER2等基因標志物，可以進行藥物靶點治療，但是三陰性乳腺癌的檢測還缺乏有效的標志物與治療方案。因此，在腫瘤蛋白質標志物研究實驗開展之前，明確臨床問題，并以此確定臨床樣品入組標準，是研究成功的核心基礎。

2．研究思路設計：

不同于基礎科學實驗，臨床實驗需要在大量樣本中進行實驗結果的驗證，因此腫瘤蛋白質標志物研究往往包括新型標志物發現和驗證兩部分。標志物發現實驗是在疾病組和對照組之間進行蛋白質組學分析，鑒定樣本中的未知蛋白質組并進行相對定量比較，分析數據選擇出在兩組樣本中差異最大的一個或幾個蛋白質作為新型標志物的候選物。隨后，標志物驗證實驗在大量未知樣本中進行蛋白質候選物的定量檢測，使用發現實驗中建立的區分標準進行判讀，計算檢測靈敏性(sensitivity)和特異性(specificity)。有效的蛋白質標志物研究往往需要發現與驗證的兩步設計思路來相互保證。

3．技術方案選擇：

根據蛋白質標志物研究的兩步設計思路，發現實驗中使用基于質譜的蛋白質組學定性技術與相對定量技術對樣本中的大量未知蛋白質進行分析，獲得標志物候選物名單。驗證實驗中根據已有名單，進行目標蛋白質(非蛋白質組學)的精確定量檢測。這幾種質譜技術的配合使用，可以滿足不同實驗情況和目的，最終實現新型蛋白質標志物的成功研發。

三、展望

質譜技術是現階段蛋白質組學研究的核心技術，具有靈敏度高、特異性強、分析通量大等優勢，特別是其與同位素內標的聯合使用，大大提高了質譜定量能力，因此在多種腫瘤標志物研究中取得了突破性進展并被廣泛應用。目前，大量腫瘤蛋白質標志物候選物已經通過使用質譜技術被從血液、組織、體液中篩選出來，預計在完成大規模臨床驗證后可以作為新型標志物在臨床使用，促進腫瘤檢測水平的發展。

同時值得注意的是，質譜技術還不具備進行蛋白質組的絕對定量能力。相對于免疫等傳統蛋白質檢測技術，儀器昂貴，操作復雜，自動化程度低，這些因素決定了質譜目前適用于蛋白質的臨床研究，但不適用于蛋白質的臨床檢驗，這是質譜技術面臨的重要挑戰之一。

參考文獻
[1]何華勤. 簡明蛋白質組學[M]. 北京:中國林業出版社, 2011:1,76,85-95,119,125-138.
[2]RuediA, MatthiasM. Mass spectrometry-based proteomics[J]. Nature, 2003, 422(13):198-207.
[3]甄艷, 施季森. 質譜技術在蛋白質組學研究中的應用[J]. 南京林業大學學報:自然科學版, 2011, 35(1):103-108.
[4]孫瑞祥, 付巖, 李德泉,等. 基于質譜技術的計算蛋白質組學研究[J]. 中國科學E輯信息科學, 2006, 36(2):222-234.
[5]WhiteleggeJ,HalgandF,SoudaP, et al. Top-down mass spectrometry of integral membrane proteins [J]. Expert Review Proteomics, 2006, 3(6):585-596.
[6]ChaitBT. Mass spectrometry:bottom-up or top-down? [J]. Science, 2006, 314(5796):65-66.
[7]TranDT, AdhikariJ, FitzgeraldMC. StableIsotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC)-based strategy for proteome-wide thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions [J]. Mol Cell Proteomics, 2014,13(7):1800-1813.
[8]DytfeldD, KandarpaM, StrahlerJR, et al. Proteomic Profiling of Multiple Myeloma (MM) Cells Using iTRAQ and Label-Free Quantitative Proteomics for the Prediction of Complete or near Complete Response (CR/nCR) In Frontline Treatment with Lenalidomide, Bortezomib, and Dexamethasone [J]. Blood, 2010, 116(21):271-272.
[9]García-SantamarinaS, BoronatS, DomènechA, et al. Monitoring in vivo reversible cysteine oxidation in proteins using ICAT and mass spectrometry [J]. Nat Protoc,2014,9(5):1131-1145.
[10]MirzaSP, GreeneAS, OlivierM. 18O labeling over a coffee break:a rapid strategy for quantitative proteomics [J]. J Proteome Res, 2008,7(7):3042-3048.
[11]曹冬, 張養軍, 錢小紅. 基于生物質譜的蛋白質組學絕對定量方法研究進展[J]. 質譜學報, 2008, 29(3):185-190.
[12]ZhangZ, BastRC, YuY,et al. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer[J]. Cancer Res,2004,64(16), 5882-5890.