質粒DNA的限制性酶切及電泳分析

原理
限制性核酸內切酶能特異地識別和切割雙鏈DNA中的堿基順序，本實驗中所用的pBS-SK質粒分子總長約2.9kb，經酶HindⅢ切割后，閉合環狀質粒DNA即變成線性DNA分子。
不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在瓊脂糖凝膠中有不同的電泳遷移率，因而可通過電泳使其分離。
試劑
1、限制性內切酶HindⅢ
2、10×酶切緩沖液
3、6×上樣緩沖液0.25％溴酚蘭；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液
4、50×電泳緩沖液
稱242g Tris堿，加H2O 800ml，待完全溶解后，加57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，用H2O定容至1000ml。臨用前用H2O稀釋成1×電泳緩沖液。
5、瓊脂糖
6、溴化乙錠(EB) 10mg/ml：取EB 0.10g完全溶解10ml水中，避光室溫保存。
EB有一定毒性，接觸含EB的溶液時，務必戴上一次性手套。
7、DNA分子量標準：λDNA/HindⅢ
操作
一、pBS-SK的限制性酶切
1、取實驗十四中制備的pBS-SK溶液5μl，10×酶切緩沖液3μl，雙蒸水20μl，混勻；
2、加核酸內切酶HindⅢ 2μl (20u/μl)，輕敲管底使內容混勻，置離心機中離心數秒。
3、置37℃水浴中保溫1小時后，即可進行電泳分析。
二、質粒DNA酶切片段的電泳分析
1、制膠先將電泳板兩端用膠布密封，在距一端約1厘米處插入上樣梳齒板，然后將電泳板水平置于實驗臺上。
稱取DNA電泳用瓊脂糖0.4g放入100ml三角燒瓶中，加40ml 1×TAE緩沖液，將燒瓶置微波爐或電爐上加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。待凝膠溶液冷卻至60℃左右時，加溴化乙錠(10mg/ml) 2μl，混勻后趁熱將凝膠溶液倒入電泳板上。室溫下待凝膠完全凝固(約需30分鐘)，揭去兩端膠布，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。
2、電泳向電泳槽中加1xTAE緩沖液至剛沒過凝膠表面。

取三支Eppendorf管，標號，如下表準備電泳樣品。

混勻后，依次全部加入三個點樣孔中，注意加樣器吸頭不可插入過深，以免刺穿凝膠，導致樣品外溢。

接通電源，調節電壓至5V/cm，電泳1小時后，將凝膠板取出。在紫外燈下觀察記錄結果。

注：本實驗使用的分子量標準為λDNA/HindⅢ，含有7個長度不等的DNA片段：23130bp；

9416bp；6557bp；4361bp；2322bp；2027bp；564bp；125bp。