一、實驗目的
·學習酚、氯仿抽提去除蛋白質的基本方法
·了解質粒DNA的抽提方法
·學習掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法
·熟練取液槍的使用方法
二、實驗原理
·在DNA的粗提液或其他的DNA反應體系中，一般都混有蛋白質、寡糖苷酸等雜質。酚和氯仿可以使蛋白質變性，離心后變性蛋白質存在于有機相和水相之間的界面，吸取上層含有DNA有水相，繼續用氯仿抽提可以進一步使殘留的蛋白質變性并去除水相中殘留的酚。由此得到純度較高的DNA水溶液，可以加鹽和乙醇最后經高速離心得到DNA沉淀。
·瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的常用方法。瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。瓊脂糖凝膠電泳通常利用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。電泳結束后，直接用低濃度的溴化乙錠染色，在紫外燈下可以確定DNA的位置。
·質粒（plasmid）通常指細菌中獨立于染色體外，能自主復制的遺傳因子，它能夠穩定地遺傳某些性狀。天然的質粒都是環狀雙鏈DNA，大小從
5kb到400kb不等。質粒雖然獨立于染色體外自主復制和遺傳，但其復制又依賴于宿主編碼的酶和蛋白質復制因子。質粒按照其穩定拷貝數的多少可分為嚴謹型和松弛型，嚴謹型質粒在每個細菌細胞中有1～5拷貝，松弛型質粒在每個細菌細胞中可達10～200個，甚至更多拷貝。
·質粒的結構：
1. 抗性基因(Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Ka-namycine resistance gene)
2. 啟始復制子(ori, Origin of replication)；
3.多克隆位點(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；
·細菌裂解的方法：
堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS
煮沸裂解法:沸水煮沸40秒
SDS裂解法：10%SDS,一般用于質粒大量提取。
·SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質粒
DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性（NaOH）環境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質粒DNA將迅速復性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質粒DNA從細菌中提取出來。
三、實驗器材與試劑
·溶液1- 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.0。
溶液2－0.2mol/L-NaOH, 1%SDS
溶液3－乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)：60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸，
28.5mL H2O
·飽和酚(pH8.0 Tris-HCl飽和)、氯仿、3M乙酸鈉溶液(pH5.2)
·TE緩沖液:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA ， pH8.0,
·100%乙醇與70％乙醇
·器材：取液槍、離心機、低壓電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀
四、實驗步驟
·質粒小量提取的方法：
1.培養細菌：將帶有質粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應抗生素的液體培養基，37℃培養12～16小時;
2.取液體培養液1.5ml X 2于Eppendorf管中，10000r/min離心1min，去掉上清液，加入100ml溶液I，充分混勻;置冰上;
3.加入200ml新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（溶液II ），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置2--3min;
4.加入150 m l乙酸鉀溶液(溶液III)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;
5.用臺式高速離心機，12000r/min離心10min，上清移入另一干凈離心管，并加3ul RNaseA, 37C保溫30min;
6.上清中加入等體積的酚/氯仿抽提一次,等體積氯仿抽提一次;每次均要振蕩—離心(10000rpm離心1min) —吸取上清到新的離心管中;
注：吸取酚時，要槍頭伸入兩液面交接處下方，因為上層為水。
7.上清中加入1/10 體積3M乙酸鈉溶液(pH5.2) ,和2.2倍體積的無水乙醇,混勻后-20℃保存15min 。
8. 12000rpm 離心15分鐘，棄去上清，沉淀加入1ml 75％乙醇洗滌， 12000rpm 離心2分鐘，徹底棄去上清，真空干燥或烘干。
9.沉淀溶解于30ul TE溶液，取10ul 電泳檢查
10．電泳結束后（溴酚藍走到膠的正中位置附近），將凝膠拿到成像系統中拍照。
·瓊脂糖凝膠電泳
電泳體系：1％瓊脂糖凝膠，
電泳緩沖液：1 × TAE （由50 × TAE稀釋）
電泳方式：穩壓，<5/cm
100ml 1％瓊脂糖凝膠配制方法：100 ml 1 × TAE溶液中加入1克瓊脂糖
染料：GoldView DNA染料
染料用量：5ul/100ml凝膠
顯色：紫外燈下，雙鏈DNA呈綠色；單鏈DNA呈紅色