實驗概要
本實驗介紹了質粒DNA小量快速提取的基本原理及操作步驟。
實驗原理
在堿性條件下，染色體DNA和質粒DNA都發生變性，但質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當用酸性的高鹽緩沖液將pH中和至中性時，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型并溶解在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，纏結的染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質—SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。上清液中的質粒DNA因不溶于70％的乙醇，可在加入乙醇后通過離心得到質粒DNA沉淀。
主要試劑
1. LB培養基
蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待完全溶解后，用1N NaOH調pH至7.0，補加重蒸水至總體積1000ml，151bf/in2高壓蒸氣滅菌20分鐘。
2. 氨芐青霉素：100mg/ml
3. 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris—HCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)
4. 溶液Ⅱ(臨用時配)：0.2mol/L NaOH，1％SDS
5. 溶液Ⅲ：0.5mol/L乙酸鉀60ml；冰乙酸11.5ml；H2O28.5ml
6. 酚－氯仿：將酚和氯仿等體積混合后用0.1mol/L Tris－HCl (pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋0.01mol/L Tris－HCl (pH7.6)液層，4℃保存。
7. 氯仿－異戊醇：將氯仿和異戊醇按24：1的比例混合。
8. TE緩沖液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT
9. RNase 1mg/ml：稱10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，此液為10mg/ml RNase濃度，應用時稀釋至1mg/ml。
10. 70％乙醇、無水乙醇
主要設備
1. 37℃搖床
2. 1.5ml Eppendorf管
3. 微量臺式高速離心機
4. 制冰機
5. -20℃冰箱
實驗材料
大腸桿菌XL1-blue
實驗步驟
1. 將含有pBS-SK質粒的大腸桿菌XL1-blue 10μl接種到10ml含氨芐青霉素(100μg /ml)的LB培養液中，37℃振搖過液。
2. 取1.5ml菌液轉入Eppendorf管中，5000rpm離心1分鐘，吸凈上清。
3. 將細菌沉淀重懸于100μl用冰預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。
4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，輕緩顛倒Eppendorf管5次，以混合內容物，禁止劇烈振蕩。置冰浴中放置5分鐘。
5. 加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，反復顛倒數次，使溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，隨后置冰浴中5分鐘。
6. 用微量臺式高速離心機12000rpm 離心5分鐘，將上清轉入另一Eppendorf管中。
7. 加等體積酚－氯仿，劇烈振蕩1分鐘后，12000rpm離心5分鐘，將上層液轉入另一Eppendorf管中。
8. 加等體積氯仿－異戊醇，劇烈振蕩10秒鐘后，短暫離心12000rpm1分鐘，將上層液轉入另一Eppendorf管中。
9. 室溫下加2倍體積的無水乙醇，振蕩混合，室溫下靜置5分鐘。
10. 12000rpm離心5分鐘，去上清液，加1ml 70％乙醇，短暫振搖，然后再離心(12000rpm分鐘)。
11. 除去所有上清液，待待殘余乙醇揮發干凈后，加30μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37℃保溫15分鐘，取出后即可用于酶切分析或置-20℃保存備用。