質粒的制備

實驗方法原理 在pH 12.0 ~ 12.6堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。

實驗材料 pUC18大腸桿菌

試劑、試劑盒 LA培養基異丙醇水乙醇

儀器、耗材 無菌牙簽移液槍震蕩器Eppendorf管離心機超凈臺

實驗步驟

1.   取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LA培養基上37 ℃過夜培養；

2.   用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養基中，37 ℃搖床~250 r/min過夜培養；

3.   吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；

4.  溶液m4. 加入300 μI振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或碎塊）； 

5.   加入300 μI溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；

6.   加入300 μI溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質充分沉淀；

7.   12000 g離心10分鐘；

8.   吸取800 μI上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；

9.   12000 g 常溫離心15分鐘；

10.   倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；

11.   室溫放置或超凈臺上風干DNA；

12.  加40 μI滅菌超純水或TE溶解；

13.   質粒、BAC的質量檢測，于-20 ℃保存。