①選擇合適的出發質粒
出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。
②正確獲得構建質粒克隆載體的元件
一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段，還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DNA片段。
③組裝合適的選擇標記基因
構建的質粒克隆載體應該組裝什么樣的選擇標記基因，必須根據要轉化的受體細胞的特性來決定。
④選擇合適的啟動子
為了構建表達質粒的克隆載體，必須組裝合適的啟動子，當設計真核生物的基因須在原核生物中表達式，常改用原核生物或病毒(噬菌體)基因的啟動子，而原核生物基因在真核細胞中表達時，仍可用原核生物基因的啟動子。