7．等位基因特異性擴增
在設計引物時，根據已知突變位點的特征，在引物3’端或中間設計一錯配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補，而只擴增相對應的突變型或野生型基因。主要用于點突變導致的遺傳病的檢測。其優點是只需一步PCR，而無需電泳和標記，擺脫了分子生物學方法中必經電泳的現象。在相互競爭的突變型和野生型引物中，分別采用不同熒光染料標記擴增的DNA，可直接對擴增產物進行判讀。另外使用具有特定酶切位點的內嵌引物，也可提高產物特異性和產量，DNA擴增后用酶切割，由酶切產物可明確是否有基因突變，該法已應用于單個精子的DNA分析。
8．全基因組擴增技術
PGD的難點之一是可檢測的材料極為有限，通常僅l一2個卵裂球細胞，約15–30pg的基因組DNA，很難進行一個基因的多種突變或多位點基因的改變的基因分析。全基因組擴增技術建立和成熟對PGD的開展具有重要的意義。主要有引物延伸前擴增和簡并寡核苷酸引物PCR兩種方法。它能夠無選擇偏移的擴增全部DNA序列，從理論上講，任何基因都能從全基因組擴增產物中檢測出，可用于多個突變位點的單基因病、多基因病的診斷及染色體組分析等。
9．微衛星DNA的PCR 多基因遺傳病和先天畸形，目前其易感基因研究常用的遺傳標記是微衛星標記。微衛星DNA(miCrosatcllite
DNA)又稱簡單重復序列(Sim–pierepcned
scquence，SRS)，能參與遺傳物質的結構改變、基因調控，是基因重組和基因變異之源。脆性X染色體綜合征、強直性肌營養不良、脊髓小腦共濟失調等遺傳性疾病都與之有關。該方法已用于脆性X染色體的PGD。此外，微衛星DNA多態性的特點可以用來分析單細胞DNA擴增產物的來源及純度。通過檢測進行PGD的雙親的STR等位基因的大小，估計合子的類型。任何可能性之外的基因型都提示存在污染，包括來自母體細胞的污染。這種方法同樣也可以發現單體型及同一來源的二倍體。對反復發生的葡萄胎有診斷價價值．
l0．RT–PCR
單基因疾病植入前診斷誤診的原因很大程度上是由于僅有單個DNA拷貝導致擴增失敗或污染以及等位基因脫扣。RNA分析如果已知某種與遺傳病有關的基因在體外培養期間確實已開始表達，那么將致病基因表達的mRNA反轉錄成cDNA，對cDNA進行擴增，來檢測目的基因，所需的底物拷貝數相對較多，有可能解決單個DNA拷貝對植入前診斷發展的限制。目前已將該法應用于Marfan氏綜合征患者的PGD。
二、單細胞經上述PCR后主要有以下幾種方法進行基因診斷
1．根據特異性擴增帶做出診斷 這主要對于基因缺失引起的疾病有重要意義。如α一地中海貧血等診斷。根據擴增片段長度的不同可以區分正常組與異常組。此外，為排除PCR反應體系不適造成的假陰性，應在同一反應體系中加入另一對引物擴增其他非缺失序列作為內對照。
2．限制性酶譜直接分析法
限制性內切酶具有識別DNA中特定核苷酸順序，如某種限制性內切酶，其切點在被檢測基因內或外圍，酶切后該基因存在于特定長度的片段中，在正常情況下所切出的片段長度是固定的，當基因發生突變后，核苷酸順序發生改變，就可導致限制性內切酶的酶切位點改變，切點消失或產生新切點，從而使片段大小也發生改變。
PCR后，用限制性內切酶切PCR產物，根據電泳后酶切片段長度的變化，即可做出診斷。適用于已知點突變遺傳病、基因缺失及基因增加或大片段插入等遺傳病的診斷。
3．限制性片段長度多態連鎖分析法
指在人群中用同一限制性內切酶消化基因組DNA，可產生不同長度的DNA片段，稱為限制性片段長度多態(RFLP)，按孟德爾規律遺傳，目前大多數單基因病的基因結構、基因產物以及突變性質等都還不完全清楚，不可能用直接法診斷，這類遺傳病可在致病基因附近尋找一個或幾個與基因相連鎖的DNA多態作為特定遺傳標記，通過先證者及其家系成員的分析，但父母必須是RFLP雜合子，就可間接判斷致病基因的存在與否，既間接診斷，故稱RFLP連鎖分析間接診斷.
4．寡核苷酸探針一一斑點雜交檢測法
適用于任何已知點突變性質的遺傳病，特別是具有遺傳異質性的遺傳病，如s地中海貧血。方法為針對已知的點突變，合成一對寡核苷酸探針
cleotide．probe)，一個為正常基因片段與相應正常序列完全互補；另一個為突變基因片段，與相應的突變基因完全互補。探針經標記后與經PCR
擴增后的擴增產物進行斑點雜交，就可直接顯示突變基因是否存在，直接做出診斷。早期寡核苷酸探針一一斑點雜交，是先將待檢測DNA或PCR產物固定在尼龍膜上，再與寡核苷酸探針一一斑點雜交，但每次只能檢測一種突變。后來發展的反向點雜交(re–verse
dot blot，RDB)，是將生物素標記的寡核苷酸探針固定在尼龍膜上，再與PCR產物雜交，一次可檢測多種突變，大大提高了診斷效率。
5．單鏈構象多態性(SSCP)
是一種篩選方法，在l00一500個堿基對中只有一個堿基對的異常時，它也可以發現。在PCR過程中產生的單鏈，通過鏈內的相互作用會產生序列特異性形態。一個堿基對的變化就可以使DNA單鏈顯示出根本不同的形態，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中會顯示不同的條帶，從而可以區分正常及異常等位基因。由于有多點突變的復雜雜合子會呈現特異的條帶而得以診斷。SSCP是最常用的基因突變診斷方法。因所需儀器設備較少，步驟簡便，價格便宜，可以用溴化乙錠或高敏感性的銀染的方法代替放射性同位素等優點使SSCP得到廣泛應用。但所選的凝膠會影響單鏈的遷移，從而影響實驗結果，溫度也是影響因素之一。不同的單鏈有不同的適宜溫度。因此，有可變的凝膠系統是很重要的，可以為不同的突變選擇不同的最佳溫度。SSCP異源DNA鏈分析可共同用于家族性結腸息肉的植入前遺傳學診斷。因為這兩種方法所用凝膠相似，所以可以同時應用。
6．變性梯度凝膠電泳(DGGE)
有一種只用于PGD的技術是變性梯度凝膠電泳(DGGE)，與SSCP一樣，是以不同堿基對特異性序列具有不同物理特性為原理的篩選方法。突變序列在聚丙酰胺凝膠電泳中當變性劑濃度增加使具有不同的融化特性，從而影響遷移率。在行DGGE之前的PCR引物中通常增加4O個左右的鳥嘌呤或胞嘧啶殘基。這一序列能明顯增加DNA片段中變異序列的檢出率(檢出率為95％)。然而，有時鳥嘌呤或胞嘧啶殘基會降低PCR效率，在單細胞水平，可能會使PCR失敗。以鳥嘌呤或胞嘧啶殘基作為內側引物進行巢式PCR可以解決這一問題。DGGE植入前遺傳學診斷中用于各種類型的s一球蛋白突變的診斷。
7．基因芯片(DNA chip，gerle chip)
這是以DNA堿基配對、序列互補原理為基礎分辨單個核苷酸，實現DNA序列的分析。具體步驟包括：①DNA陣列的集成：即將大量DNA特殊片斷作為探針，固化在載體上，形成密集、有序的分子排列；②樣品的制備和分子雜交：純化DNA或RNA待測樣品，與基因芯片進行分子雜交；③雜交信號的檢測和分析：通過熒光掃描檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量，使樣品中的基因成分被鑒定。由于基因芯片具有巨大的分析能力，樣品的用量極少，使用簡便，還因具有可在同一雜交板上同一雜交反應中進行不同樣品的比較等優點，具有高度的敏感性和特異性，可以獲得豐富的信息，故對一些基因突變和基因拷貝數改變的遺傳性疾病的診斷，該方法顯得非常重要。
總之，隨著對單細胞分析所遇困難的深入理解，單細胞診斷技術在不斷提高。無論單細胞診斷會面臨什么樣的困難，相信隨著分子生物學技術的發展和人類基因組計劃的完成，將有更多、更先進的方法應用于更多種遺傳性疾病的植入前遺傳學診斷。