實驗材料 蛋白質
試劑、試劑盒 Tris·ClSDS
儀器、耗材 電泳儀離心機真空泵
實驗步驟
1. 按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃平板和0.75 mm 墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上
2. 配置分離膠液體并脫氣，然后加10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
3. 用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層中，至凝膠約11 cm 高為止。
4. 用另一根巴斯德吸干，先從一邊的墊片，在從另一邊墊片往夾層的頁面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇。讓凝膠在室溫聚合30~60 min。
5. 傾去頂層的異丁醇，并以1×Tris·Cl/SDS，pH8.8緩沖液沖洗凝膠的頂部表面
6. 配制積層膠液體，用巴斯德吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至離夾層的頂部約1 cm 高為止。
7. 將0.75 mm 厚的Teflon梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩余空間。讓積層膠室溫聚合30~45 min。
8. 在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩沖液按1：1稀釋待測蛋白質樣品，于100℃煮沸3~5 min。如樣品是蛋白質沉淀物，加入50~100 μl 1×SDS加樣緩沖液溶解之，并同樣在100℃煮沸3~5 min。按供應商的使用指南用1×SDS加樣緩沖液溶解蛋白質分子量標準混合物。
9. 小心拔出了Teflon梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×SDS電泳電極緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。
10. 按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室，同時往下緩沖液室加入推薦量的1×SDS電極緩沖液。
11. 將固定于上槽的凝膠板放入下槽中，并往上槽加入部分電極緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12. 用帶平嘴針頭的25 μl 或100 μl 注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體枳的空白1×DS樣品緩沖液，以防相鄰泳逭樣品的擴散。
13. 再往上槽加入余下的1×SDS電極緩沖液，以能將上槽的鉑金電極完全淹沒為準。此操作須緩慢小心，以防沖起樣品孔中的樣品。
14. 連接電源，對于0.75 mm 厚的垂直板電泳，先在10 mA 恒流下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電流調至15 mA繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15. 關閉電源并撤去連接的導線，棄去電極緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16. 將凝膠定位以便識別加樣的順序,將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾。
17. 小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿撬起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18. 小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠后仍能認出加樣次序。接著就可進行蛋白質的檢測。