蛋白質化學交聯結合質譜鑒定技術取得新進展

　　3月8日，國際著名期刊《eLife》在線發表了北京協和醫學院、北京生命科學研究所（NIBS）、北京大學和清華大學等處的一項最新成果，題為 “Trifunctional cross-linker for mapping protein-protein interaction networks and comparing protein conformational states”。在這項研究中，研究人員開發了一種賴氨酸靶向交聯劑，以改進創新性的技術——蛋白質化學交聯結合質譜鑒定技術（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）。

　　NIBS的董夢秋和雷曉光兩位研 究員是本文共同通訊作者。董夢秋研究員早年畢業于四川大學，1995年碩士畢業于中科院上海生化所，2001年博士畢業于耶魯大學，曾經在美國加州大學圣 地亞哥分校、斯克利普斯研究院從事博士后研究，2007年至今，北京生命科學研究所研究員。2012年，董夢秋實驗室與賀思敏教授研究組合作，研發出了一 套完整的基于高精度質譜鑒定化學交聯肽段的新技術方法，這一研究成果公布在Nature Methods雜志（NIBS董夢秋組發表Nature子刊文章；專訪董夢秋：學科交融，思想交融的結晶）。 雷曉光研究員2001年畢業于北京大學化學系，2006年博士畢業于美國波士頓大學，曾在哥倫比亞大學從事博士后研究，2008年底全職回國，曾任天津大 學藥物科學與技術學院藥物化學系教授，博士生導師，北京生命科學研究所研究員。有多項研究成果發表在Nature，Cell，Nat.Chem. Biol.，Angew. Chem. Int. Ed.，J.Am. Chem. Soc.，Chem. Sci.和Cell Res.等國際頂級刊物上（NIBS沈志榮、雷曉光Cell子刊發表程序性壞死研究新成果；NIBS雷曉光實驗室報道天然產物首次仿生全合成）。

　　在不同的復合物中，蛋白質通過與多個蛋白質合作伙伴相互作用，而執行不同的功能。研究蛋白質復合物結構和蛋白質間相互作用，對于理解它們的功能是至 關重要的。近年來，蛋白質化學交聯結合質譜鑒定技術（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）已經成為分析這種結構和相互作用的有力工具。與傳統方法相比，CXMS方法耗時少，對樣品純度要求不高；因此，這種技術受到 越來越多的歡迎。

　　隨著分析儀器發展的最新進展，交聯試劑和軟件，已經使CXMS從默默無聞到日益突出，并涌現出一系列成功的應用案例。然而，CXMS仍受到樣品復雜 性和交聯肽低豐度的限制。為了降低大分子復合物包含的樣本的復雜性，通常需要廣泛的分餾。在更異質性的樣本中（如天然免疫沉淀物和全細胞裂解液）確定交聯 肽，甚至更為困難。

　　考慮到樣品中交聯肽的稀疏性，交聯后使用親和標記物將它們從復雜的混合物中純化出來，將是有利的。然而，盡管研究人員加大了力度，開發具有富集功能的化學交聯劑，但是只有很少一些藥物已被證明能提高復雜樣品的識別能力。

　　在這項工作中，研究人員開發了一系列的化學交聯劑，它們具有一種之前首創的模塊化設計。它們都包含一種用于親和純化的生物素標記物，和一個裂解位點 ——可用于將交聯肽從鏈霉親和素磁珠上釋放出來。研究人員選擇了具有最佳性能的交聯劑，并開發了一種強大的富集程序，具有97%以上的濃縮效率。他們稱之 為賴氨酸靶向富集交聯劑（Leiker）。研究人員利用之前開發的pLink識別軟件，表明用Leiker可有效地促進各種各樣樣本類型的CXMS分析，從純化的復合物、天然免疫沉淀物，到高度復雜的全細胞裂解液。

　　交聯劑修飾的肽的定量，有可能檢測到蛋白質的構象變化和分子間相互作用的變化，雖然這些方法不是很成熟。為了解決這項技術的這個潛在關鍵應用，該研 究小組合成了穩定的同位素標記的Leiker。同時，他們構建了自動化數據分析流程，用于輕和重Leiker交聯連接的相對定量。

　　作為一個概念驗證，研究人員對一個RNA結合蛋白L7Ae，進行了定量CXMS分析。使用氘標記的Leiker，研究人員發現，正如預期的那樣，在 存在RNA的情況下，包埋在RNA結合的三個L7Ae賴氨酸殘基，它們的單一連接大幅度下降。研究人員進一步將量化CXMS的應用，延伸到了一個高度復雜 的系統，包含對數期和穩定期的大腸桿菌細胞，并鑒定了一個生長期特異性的蛋白質相互作用。