藻酸鹽包被

D-PBSA胰蛋白酶

適合細胞生長的培養液藻酸鈉溶液

無菌濾器

鹽溶液，含有：

(a)NaCl，8.0 g

(b)D-葡萄糖，1.0 g

(c)用 UPW 配制1 L

(d)用 HCl 或 NaOH 調整 pH 為 7.2~7.4

(e)高壓滅菌

0.1 mol/L CaCl₂，含有：

(a)鹽溶液，500 ml

(b)CaCl_2· 2H₂O，7.35 g

(c)用 HCl 或 NaOH 調整 pH 為 7.2~7.4

(d)高壓滅菌

1. 按 1.5 % 濃度將藻酸鹽溶解于鹽溶液中，在室溫下將溶液攪拌至少 4 h，直至藻酸鹽完全溶解。溶解于鹽溶液的藻酸鹽可以在4℃條件下儲存 3 d。

2. 用滅菌的無熱源活性的 0.45 um 濾器將藻酸鹽過濾 3 次。最后一次過濾應當在藻酸鹽使用前進行。

3. 將細胞培養至匯合狀態。

4. 用 3 ml 胰蛋白酶（適合于細胞傳代培養的濃度）消化細胞，然后細胞計數。

5. 將細胞離心（900 r/min，4 min ) 后，完全棄去含有胰蛋白酶的上清液。

6. 通過將細胞輕輕地懸浮于藻酸鹽中，使細胞與藻酸鹽混懸，調整細胞密度為 2x10⁶ 個/ml。此刻，在藻酸鹽中不產生氣泡是至關重要的，因為產生氣泡將會導致微珠內形成空隙。

7. 將藻酸鹽懸浮的細胞轉移入套有 27G 針的無菌注射器中。

8. 利用迂冋運動將藻酸鹽細胞懸液滴加入含有 0.1 mol/L CaCl₂ 的燒杯中，CaCl₂ 誘發藻酸鹽微珠的形成。

9. 使微珠膠化 10 min，然后用 D-PBSA 洗 3 次。

10. 最后用生長培養液洗微珠。

11. 將微珠放入含有生長培養液的 175 cm² 培養瓶中，在 37℃、100 % 相對濕度和 5% CO₂ 條件下培養。