1．點樣：
⑴ 樣品的溶解：將樣品溶于展開劑極性相近、揮發性高的有機溶劑。
⑵ 薄層點樣：用毛細管（0.5mm以下）或用專業點樣器進行點樣。
點樣的要求：樣點位置應在距離底邊1-1.5cm處；點樣量適當；樣點直徑小于2-3mm；間隔反復點樣；多個樣點時，間隔為2cm且處于同一條直線上。
經驗做法：可先在PC或TLC點上不同量的樣品，并展開、顯色后觀察分離情況，以此確定最佳樣品用量。
2．展開：當樣點上的溶劑充分揮干后，將薄層放置在密閉容器中，使適當的展開劑從薄層的一端向另一端進行浸潤展開的過程。
要求：密閉容器可選用層析缸、標本缸、標本筒等；展開方式有上行法、下行法之分，展開方向有單向、雙向、多次展開等。詳見P33。
注意事項：先懸空飽和、再入液展開；樣點不能泡在展開劑中；薄層浸入時不能歪斜進入。
3．顯色：用適當的方法或者適當的顯色劑處理薄層，使其上可能已經分離的各成分斑點顯示出來，以方便計算各個斑點的比移值，從而提供定性與定量的依據。
顯色的基本步驟是：一看、二照、三碘、四顯，熒光背景也常見。詳見P34。
4．比移值的計算與定性、定量：展開結束后，經過各種顯色操作后，樣品中各個成分的斑點可能出現了不同程度的分離，為了表達各成分的相對位置（極性）通常以比移值作為稱量斑點位置的指標。比移值的符號為Rf：
Rf＝(斑點中心與原始樣點之間的距離)/(溶劑前沿與原始樣點之間的距離)
注意事項：薄層層析的Rf 值受多種因素影響，即使嚴格按照實驗要求做了，結果的重現性仍較差。因此，薄層定性時常與標準品一起點樣進行對比分析。
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