蔬菜中有機磷農殘快速檢驗法——酶抑制率法(分光光度法)

實驗概要

學習酶抑制率法測定果蔬有機磷和氨基甲酸脂類農藥殘留的原理和方法，注意實驗過程的操作要點。

實驗原理

根據有機磷和氨基甲酸酯類農藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反應底物碘化乙酰硫代膽堿和乙酰膽堿酯酶，如果蔬菜不含有機磷或氨基甲酸酯類農藥殘留或殘留量低，酶的活性就不被抑制，實驗中加入的底物就能被酶水解，水解產物與加入的顯色劑反應產生黃色物質。如果蔬菜的提取液含有農藥并殘留量較高時，酶的活性被抑制，底物就不被水解，當加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計在412nm處或農藥殘毒快速檢測儀測定吸光值，根據計算出的抑制率，就可以判斷蔬菜中含有機磷或氨基甲酸酯類農藥殘留量的情況。

主要試劑

1. pH8.0緩沖液  分別稱取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000 mL蒸餾水中。

2. 乙酰膽堿酯酶(實驗專用酶)  根據酶活力用緩沖溶液溶解，3 min的吸光值變化ΔA₀值應控制在0.3以上。搖勻后在0~5℃冰箱中保存，保存期不超過4天。

3. 底物碘化乙酰硫代膽堿  稱取25.0 mg碘化乙酰硫代膽堿，用3.0 mL緩沖溶液溶解，在0~5℃下保存。保存期不超過2周。

4. 顯色劑  分別稱取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。

5. 可選用由以上試劑配置的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的ΔA₀值應控制在0.3以上。

主要設備

1. 分光光度計或相應的農殘快速檢測儀；

2. 天平(0.01g)；

3. 恒溫水浴或恒溫培養箱。

實驗材料

待測果蔬

實驗步驟

1. 樣品處理

選取有代表性的蔬菜樣品，去掉不可食部分后稱取蔬菜試樣，沖洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。取樣品1 g，放入燒杯或提取瓶中，加入5 mL緩沖液，振蕩1~2 min，倒出提取液，靜置3~5 min，待用。

2. 對照溶液測試

先于試管中加入2.5 mL緩沖液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL顯色劑。搖勻后于37 ℃放置15 min以上(每批樣品的控制時間應一致)。加入0.1 mL低物搖勻，此時檢液開始顯色反應，應立即放入比色皿中，記錄反應3 min的吸光度的變化值ΔA₀。

3. 樣品溶液測定

先于試管中加入2.5 mL樣品提取液，其他操作與對照測定相同，記錄反應3 min的吸光度的變化值ΔA_t。

4. 結果計算：

              抑制率(%)=

        式中   ΔA₀——對照液反應3 min吸光度的變化值；

              ΔA_t——樣品溶液反應3 min吸光度的變化值。

5. 實驗結果判斷：

當蔬菜樣品提取液對酶的抑制率大于50% 時，表示樣品中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥殘留，可判定樣品為陽性結果，對檢驗結果陽性的樣品需重復檢驗兩次以上。

檢驗結果記錄：

注意事項

1. 對檢驗結果陽性的樣品，需用其他方法進一步確定殘留農藥的種類和進行定量測定。

2. 酶抑制率法對部分農藥的檢出限為：

3. 蔥、蒜、蘿卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質，容易產生假陽性，處理樣品時，可采取整株(體)蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株(體)蔬菜浸提法，減少色素的干擾。

4. 當溫度條件低于37℃，酶反應速度隨之放慢，藥片加液后放置反應的時間也應相對延長，延長時間的確定，應以膽堿酯酶空白對照測試的吸光度變化

ΔA₀在0.3以上為準。注意樣品放置時間應與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。酶的活性不夠和溫度太低都可能造成膽堿酯酶空白對照液3 min的吸光度ΔA₀變化值＜0.3。

5. 該法適用于大量蔬菜樣本的篩檢，不適用于最后的仲裁檢測。