脂質體介導的瞬時轉染

實驗材料 靶細胞DNA

試劑、試劑盒 陽離子脂質D-PBSA緩沖鹽溶液NaCl 0.25%胰蛋白酶

儀器、耗材 細胞培養基還原的血清培養基無血清培養基多孔培養板

實驗步驟

A . 貼壁細胞的轉染

1. 將 1.3X105 個細胞/孔接種到 6 孔培養板，加 3 ml 培養基。

2. 于 37°C 的 CO2 孵箱培養至 50%~90% 匯合。這一過程至少需 16 h , 通常為 18~24 h。

3. 轉染前，在無菌試管中制備 DNA 及脂質體溶液：

(a) 對于 DNA 溶液，將 1~2 μg DNA 在 0.5 ml 的還原血清中稀釋

(b) 對于脂質體溶液，取 2~25 μl 的陽離子脂質試劑稀釋到 25 μl， 再加入 0.5 ml 的無血清培養基（無血清或抗生素的 DMEM）。

陽離子脂質

Lipofectamine: 多價陽離子脂質體 DOSPA 與中性脂質體 DOPE 3 : 1 (w /w )混合物（Invitrogen )

Lipofectin: 即陽離子脂質體 DOTMA (N -[l -(2，3 dioleyloxy)-propyl]-N，N ,N -trimethylamonium chloride) 與中性脂質體 DOPE 1 : 1 (w /w ) 混合物（Invitrogen)

LipofectACE : 為合成陽離子 DDAB 脂質體與神經脂質 DOPE 體1 : 2.5 (w /w )混合物（Invitrogen )

(c) 將兩溶液混合，小心混勻，然后室溫下靜置 15~45 min，以使 DNA -脂質體形成混合物。

4. 用 2 ml 無血清培養基漂洗細胞。

5. 將 DNA-脂質體混合物鋪布在培養細胞之上，轉染試劑應不含抗生素。

6. 將轉染細胞于 37℃ 的 CO2 培養箱孵育 2~24 h ，一般 5~6 h 即可。

7. 孵育后，棄除轉染混合物，改加 3 ml 完全培養基。

8. 18~24 h 后換液（仍為完全培養基）。

9. 依實驗要求，吸取培養基或收獲細胞，測定基因瞬時表達的活性（見方案 27. 14 和方案 27. 15)。

B. 懸浮細胞的轉染

1. 在無菌試管中制備轉染的混合物，如下所示：

(a) 將 2.5 μg DNA 以 0.5 ml 的還原血清培養基稀釋。

(b) 將 2~20 μl 陽離子脂質體試劑以 0.5 ml 無血清培養基稀釋。

(c) 混合兩種溶液，輕輕混勻，然后于室溫下孵育 15~45 min，使 DNA-脂質體混合物形成。

2. 將 1X106~2X106 個細胞懸浮液離心，棄去培養基。

3. 在轉染混合液中將細胞再制成懸浮液，將其轉移至一個 35 mm 培養皿。

4. 在 CO2 培養箱中孵育細胞 4~6 h。

5. 向每個培養皿中加入 0.5 ml 含 30 % 血清的培養基（懸浮細胞對脂質試劑的毒性極為敏感，為避免細胞破壞，應加大量的血清保護細胞）

6. 在 CO2 培養箱中過夜培養。

7. 次日，向每個培養販中加入 2 ml 完全培養基，在 CO2 培養箱中繼續培養。

8. 在轉染后 24~72 h ，依實驗要求，吸取培養基或收獲細胞，測定基因瞬時表達的活性（見方案 27. 14 和方案 27. 15)。