脂肪細胞的原代培養

發布時間：2020-08-17 22:40 原文鏈接：脂肪細胞的原代培養

實驗材料 DMEM-ADMEM-B膠原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

試劑、試劑盒 KRBH緩沖液KRBH-A緩沖液

儀器、耗材 Petri培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍濾網尖解剖剪Perry鑷塑料箱鍘刀移液器

實驗步驟

一、切除附睪脂肪墊

1. 在充有 70 % CO2 和 30 % O2 混合氣體的塑料箱內麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用鍘刀斷頭放血。

3. 將鼠體在 70 % 乙醇內浸泡一會兒。

4. 盡量在無菌條件下切除附睪脂肪墊。

(a)用一把解剖剪剖開下腹部皮膚，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖開腹膜，然后用 Perry 鑷向上牽拉睪丸。

(c)剪取附睪脂肪墊，注意保留血管。

5. 將組織移送到培養實驗室。

脂肪細胞的膠原蛋白酶（在 2 ml KRBH 緩沖液加入 20 mg/ml 膠原蛋白酶，然后用 0.22 μm 濾器過濾）消化和洗滌

6. 將 4 g 脂肪墊（相當于 8 個附睪的脂肪墊）放入盛有 4 ml KRBH 緩沖液（Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 緩沖液時，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 7H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷，加超凈水至 1 L。然后，按 100 ml 分裝。使用前加熱至 37°C，并將 pH 調整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶內。

7. 將脂肪墊剪成直徑約為 2 mm 的組織塊。

8. 將組織塊放入瓶內，然后加入 1 ml 膠原蛋白酶液。在 37°C 水浴振蕩器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體。

9. 膠原蛋白酶消化后，向瓶內加入 4 ml KRBH 緩沖液（37°C）。

10. 通過攪拌混勻瓶內的細胞，然后用孔徑為 250 μm 的尼龍濾網（孔徑為 250 μm，放入支持物或漏斗內）將細胞輕輕濾入 50 ml 錐形離心管。

11. 通過向離心管內加入 30 ml KRBH 緩沖液（37°C）洗細胞。用臺式離心機短時間離心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪細胞浮在水性緩沖液的上面。

12. 通過加入 40 ml KRBH 緩沖液洗細胞，離心，除去下清液。重復該步驟 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 慶大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分裝，使用前加熱至 37°C）（37°C）洗細胞 2 次。

14. 用約 40 % cytocrit DMEM-A 混懸漂浮的細胞。

二、脂肪細胞的原代培養

15. 用 200 μl 大口徑吸頭將 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 懸液移入 60 mm 培養皿。

16. 將培養皿放入濕潤的培養箱，在 37°C 和 5 % CO2 的條件下培養 1.5 h 。

17. 向培養皿內加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此時，應進行葡萄糖攝取實驗 [ Quom 1998 ]，檢査細胞的活力。