胰島素剌激的胰島素受體自磷酸化實驗

純化的鼠肝細胞質膜部分純化的胰島素受體純化的胰島素受體豬胰島素ATP一抗二抗自磷酸化緩沖液起始溶液SDS-PAGE 樣品緩沖液蛋白質印跡轉移液封閉緩沖液Tris-HClNaClTween-20

蛋白質凝膠電泳裝置Whatman 3 MM 濾紙硝酸纖維素膜電泳轉移槽ECLTM免疫印跡檢測試劑盒

材料與設備

純化的鼠肝細胞質膜（見本單元實驗 1)

部分純化的胰島素受體，得自 WGA-瓊脂糖柱層析（見實驗本單元 3)

純化的胰島素受體，得自胰島素瓊脂糖柱層析（見實驗本單元 4)

豬胰島素〔17,5pmol/L(0.1 mg/ml)，溶于 0.001mol/LHCl〕(如 Sigma Chemical Co.13505)

ATP(20 mmol/L;pH7.4)

蛋白質凝膠電泳裝置（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

Whatman 3 MM 濾紙

硝酸纖維素膜（Schleicher and Schuell,Inc.)

電泳轉移槽（Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

一抗（抗磷酸酪氨酸抗體）（單克隆 IgG 2bk;Upstate Biotechnology,Inc.05-321)

二抗〔辣根過氧化物酶（HRP) 標記的抗鼠 IgG;Bio Rad Laboratories〕

ECLTM免疫印跡檢測試劑盒（Amersham Life Science,Inc.)

試劑

自磷酸化緩沖液（10x)

起始溶液（10x)

SDS-PAGE 樣品緩沖液（5x)

蛋白質印跡轉移液

封閉緩沖液

Tris-HCl(10 mmol/L；pH7.4)

NaCl(150 mmol/L)

Tween-20(0.1%)(TBST)

(配方, 見 試劑的配制，pp.234~240)

操作程序

自磷酸化作用

1) 配制如下混合液:



2) 混合液室溫孵育 15 min。

3) 加 2ul 20 mmol/LATP 和 4ul 10X 起始溶液，開始磷酸化反應。混合后置室溫

解育 15 min。

4) 加 10ul 5xSDS-PAGE 樣品緩沖液終止反應。

5) 樣品煮沸 5 min。

6) 樣品加載于 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，170V 電壓下電泳，至染料前沿離開凝膠。（關于 SDS-PAGE 的進一步資料，見附錄 5)

將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜

1) 于凝膠夾的一側，先放一纖維熱（fiber pad), 其上再放一張濕的 Whatman 3 MM 濾紙。

2) 將凝膠放在濾紙的上面。

3) 用水濕潤一張硝酸纖維素膜后，將它蓋在凝膠上。除去濾紙和凝膠之間的氣泡。

4) 再在硝酸纖維素膜的上面放一張濕潤的 Whatman 3 MM 濾紙

5) 再鋪上另一纖維墊，制成 三明治。

6) 合上凝膠夾。

7) 將凝膠夾放入緩沖液槽中，硝酸纖維素膜面對槽的陽極側。上述 三明治 應按如下方式排列：

陰極（黑色）

纖維墊

3 MM 濾紙

凝膠

硝酸纖維素膜

3 MM 濾紙

纖維墊

陽極（紅色）

8) 槽中充滿蛋白質印跡轉移液。

9) 置冷室，于 100V 電壓下，電泳轉移 2 h。

蛋白質印跡

1) 置硝酸纖維素膜于封閉緩沖液中，37℃孵育 1 h。

2) 將硝酸纖維素膜放于有足夠量的含一抗（10000 倍稀釋的抗磷酸酪氨酸抗體) 的 TBST 液的托盤中，保持膜濕潤確保硝酸纖維素膜面對凝膠的那一面向上。

3) 在室溫下，搖擺托盤 1~2 h。

4) 用 5 ml TBST 液洗硝酸纖維素膜 5 min。重復 4 次。

5) 加入足夠量的二抗（5000 倍稀釋的辣根過氧化物酶結合的抗鼠 IgG), 保持硝酸纖維素膜濕潤。

6) 置室溫孵育 1 h。

7) 用 5 mlTEST 液洗硝酸纖維素膜 5 min, 重復 4 次。

8) 取 ECL 蛋白質印跡試劑盒中的試劑 1 和試劑 2, 等量混合，配制化學發光測定液。

9) 將化學發光測定液倒在硝酸纖維素膜上，反應 1 min。

10) 立即排去多余的試劑。

11) 將硝酸纖維素膜置塑料包裝膜內。

12) 加磷光定位斑點（phosphorescentorientationdot)。
注：此步操作時，用 Polymark Natural Glow No. PM 501 很好使，它可在手工藝品商店買到。

13）蛋白質印跡膜曝光 5s、1min 或更長一些時間，直至得到所需的結果。